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实验十五 固定化酵母细胞发酵蜂蜜酒 一、实验目的 学习固定化酵母细胞的方法。 掌握蔗糖酶活力的检测方法。二、实验原理 固相酶又称为固定化酶， 是通过物理及化学的处理方法， 使水溶性酶和固态的水不溶性 支持物 (或载体 )相结合而制备的。 通过酶的固定化可以将酶转变成不溶物同时仍保留酶的活 力，在催化反应中具有诸多水溶性酶所不具备的优点。 常用的酶的固定化方法主要有： 物理吸附法； 2.载体偶联法 (键结合法 )； 3.交联法； 4.包埋法；就其应用技术而言，又分为固定化酶和固定化细胞二种。 相对于水溶性酶， 固定化酶的优点主要是机械强度增加，稳定性提高，可回收反复使用。 三、仪器和试剂仪器 试管、1 毫升吸管 4 支、水浴锅、精密酒精计： 分度值为 0.1%vol 、全玻璃蒸馏器： 500mL 、 高精度恒温水浴： 20.0± 0.1℃。 试剂 海藻酸钠若干克； K 号酵母液； 10％蔗糖液：称取 10 克蔗糖用水定容至 100 毫升； 斐林试剂。 四、操作步骤 l、称取海藻酸钠 1 克加入 100 毫升水中，微火加热溶解后冷却到 30℃左右，将预先准 备好的 3 克卡氏酵母 (或 K 号酵母的培养液 30 毫升 )的悬液加入混匀。 然后倒入下边装有胶 管与止血夹的漏斗中，让其慢慢滴入 4％氯化钙溶液中，制成直径 2－3 毫米的球形固定化 酵母。 将此固定化酵母装入柱中，从柱上端加入 10％的蜂蜜溶液，控制一定的流速，且注意 室温要在 25~28℃。 2、 24 小时后测定流出液中的还原糖含量和酒精度。 （ 1） 葡萄糖测定 空白液测定：吸取斐林试剂甲、乙液各 5ml，置入 150ml 三角瓶中，加空白液 5ml，并 用滴定管预先加入适量的 0.1%标准葡萄糖溶液，使后滴定时消耗 0.1%标准葡萄糖溶液在 1ml 以内，加热至沸，立即用 0.1% 标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失，此滴定操作在 1min 内 完成。 糖化液测定：准确吸取 5ml 糖化液代替 5ml 空白液，其余操作同上。 1 （ 2）酒精度的测定 蒸馏 在 20℃± 5℃的工作条件下，进行该试验。用一洁净、干燥的 100mL 容量瓶准确量取 100.0mL 样品（液温 20℃）于 500mL 蒸馏瓶中，用 50mL 水分三次冲洗容量瓶，洗液并入 蒸馏瓶中，再加几颗玻璃珠，连接冷凝器，以取样用的原容量瓶作接收器（外加冰浴） 。开 启冷却水，缓慢加热蒸馏。收集馏出液接近刻度，取下容量瓶，盖塞。于 20 ℃水浴中保温 30min ，补加水至刻度，混匀，备用。 酒精度的测定 将蒸馏液（注入洁净、干燥的量筒中，静置数分钟，待酒中气泡消失后，放入洁净、擦 干的酒精计，再轻轻按一下，不应接触（文章来源：华夏酒报·中国酒业新闻网）量筒壁， 同时插入温度计，平衡约 5min，水平观测，读取与弯月面相切处的刻度示值，同时记录温 度。根据测得的酒精计示值和温度，查表，换算为 20℃时样品的酒精度（所得结果应表示 至一位小数）。 五、思考题 1.固定化细胞的方法有哪些？ 2.细胞固定化时选择哪一时期的细胞较好？ 附录一 酵母原生质体融合试验用培养基 (包括酵母单倍体原生质体融合及电场诱导酵母原生质体融合） 完全培养基葡萄糖 2 g 蛋白胨 2 g 酵母膏 1 g 蒸馏水 100 mL pH 7.2 100 Pa 灭菌 20 min 。 如需配成固体完全培养基时，则需在上述液体培养基中加入 2％琼脂。 基本培养基 (用于单倍体酵母原生质体融合试验) 葡萄糖柠檬酸钠培养基葡萄糖 0.5 g (NH 4)2SO4 0.2 g 柠檬酸钠 0.1 g MgSO 4·7H 2O 0.02 g K 2HPO 4 0.4 g KH 2PO4 0.6 g 纯化琼脂 2 g 2 蒸馏水 100 mL pH 6.0 100Pa 灭菌 20 min 。 YNB 培养基葡萄糖 2 g 酵母氨基 (YNB)* 0.67 mL 琼脂 (经纯化处理 ) 2.0 g 蒸馏水 100 mL pH 6.0 100 Pa 灭菌 20 min 。 再生完全培养基 在固体完全培养基中加入 0.5 mol/L 蔗糖（或 0.8 mol/L 甘露醇或 1 mol/L 山梨醇）。 基本培养基（用于电场诱导酵母原生质体融合试验）葡萄糖 2 g 酵母氨基 (YNB)* 0.67 mL 琼脂 (经纯化处理 ) 2.0 g 蒸馏水 100 mL pH 6.0 100 Pa 灭菌 20 min 。 *YNB 培养基由以下 A 、B 、C 三种溶液混合而成，取 A 1 mL ，B 1 mL ，C 10 mL ，无离子 1000mL ， pH6.5。 A 液 维生素混合液 VB1 1000 mg ，箊酸 400 m