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通过测定血浆和尿液中的肌酸和胍基乙酸来诊断肌酸代谢疾病 Qin Sun 和 William E. O’Brien 摘要 肌酸代谢疾病包括肌酸运载体缺乏，还有参与肌酸合成的精氨酸 -甘氨酸脒基转移酶（AGAT）和胍乙酸甲基转移酶（GAMT）这两种酶的 缺乏。实验室对这些疾病的诊断依赖于血浆和尿液中肌酸和胍乙酸的 测定。这里我们记述一种快速 HPLC/MS/MS 法，测量将分析物衍生化 后经正相 HILIC 分离后的产物。 关键词 ：肌酸，胍基乙酸，精氨酸-甘氨酸脒基转移酶，AGAT ，胍 基乙酸甲基转移酶，GAMT，肌酸运载体，质谱分析法 1. 引言 肌酸和磷酸肌酸对于细胞内ATP 能量池的时空调控至关重要（1-3）。 人类从膳食来源和内源获得肌酸，后者通过精氨酸-甘氨酸脒基转移 酶（AGAT）和胍乙酸甲基转移酶这两种酶参与的较短的两步法合成通 路，提供高达 50%的日常肌酸要求。在第一步中，精氨酸-甘氨酸脒基 转移酶催化从甘氨酸和精氨酸合成 氨酸和胍基乙酸（GAA）。然后胍 乙酸甲基转移酶把 GAA 转化成肌酸，此步反应需要 s-腺苷甲硫氨酸 （SAM）作为甲基供体，而且是最大的 SAM 消耗反应。大部分肌酸合 成发生在肾脏，然后由肌酸膜运载体接受（CRT）（4） 1 这些疾病涉及到肌酸合成和膜上肌酸运载体两者（5-10）。这些病 都是罕见的，至今只有两例 AGAT 缺乏；一百多例 GAMT 缺乏和几例 CRTR 缺乏，但是很可能随着对这些病了解的增多，将发现更多的病 例。婴儿期和童年期的病人表现为发育迟缓，肌张力减退，也出现过 几例癫痫。对于 GAMT 缺乏的病人，在婴儿期肌酸处于低水平到正常 限值内，但是如果先证者实行严格的素食，在青春期肌酸会下降。高 血浆 GAA 浓度被认为能确诊 GAMT 缺乏。这些病人脑部的磁共振检 查显示肌酸缺乏和磷酸胍乙酸累积（11）。对于 AGAT 缺乏，生物化学 检测显示血浆中肌酸和肌酐量极低， GAA 的浓度也低。通过测量羊 水中的胍乙酸，产前诊断是可能的（12）。 肌酸运载体，在给脑、骨骼和心肌提供充足能量上起到重要作用， 对肾脏再吸收肌酸也至关重要，也负责GAA 的大脑分佈和摄取（13,14）。 运载体由 X 染色体上的一个基因（SLC6A8）编码。这个基因的突变也 在 X 相关智力迟钝的病人中发现（6, 7, 15–17）。生物化学变化在初发 病例中表现为尿肌酸/肌酐的比值升高。有趣的是，在一碳甲基代谢被 妨碍的紊乱中也报告了胍乙酸和/或肌酸排泄变化，例如，在 s-腺苷甲 硫氨酸水解酶缺乏和钴胺素缺乏的情况下（18,19）。 对乙酸和肌酸测定已报道过数种方法，如使用 HPLC, GC/MS,和 HPLC/ 串联 MS （20-23）技术的方法。虽然用这些方法定量尿液中高浓 度的胍乙酸和肌酸没有困难，但是难于准确测量 AGAT 缺乏时出现 2 的低血浆胍乙酸浓度不够灵敏。我们描述了一种改良的串联 MS 方案， 使用衍生分析和亲水交互作用柱（HILIC）。HILIC 是正相色谱分析法 的变体，用于分离非常极性的物质。这个方法足够灵敏，能测量低浓 度的胍乙酸并能同时分析尿液和血浆的样品。 2. 材料 标本要求 1. 血浆样品（肝素钠抗凝）：立即离心样品并把血浆 （0.5–1.0 mL）转移到标记的试管中。在-16 或以下冷冻储存。样品应该在 收集后的两周内分析。样品在收集地点和实验室之间的运输应该 有干冰（见备注 1）。 2. 尿液样品：冷冻 2–5 ml 尿液。标本可以冷冻储存 2 周。样品 在收集地点和实验室之间的运输应该有干冰（见备注 1）。 试剂 1. 1%甲酸铵：在 800ml HPLC 级 H O 中添加 10ml 甲酸，用浓 2 氢氧化铵溶液调整 pH 到 4.0，使总体积达到 1 升。在室温储存。可 稳定 2 年。 2. HPLC 运行缓冲液：包含 0.05% 甲