实验酶切切与连接.pptVIP

DNA克隆(重组)技术的基本程序包括: (1)获得外源DNA:外源DNA是进行DNA重组的目的 DNA片段,一般采用DNA聚合酶链式反应PcR或逆转录 DNA聚合酶链式反应( RT-PCR)、基因组文库或cDNA文库 筛选等方法获得 (2)载体的构建或选择:分子生物学中用的载体是指能在 特定宿主细胞中自主复制的DNA分子,例如细菌的质粒 噬菌体、病毒等,常用的载体一般为质粒;根据需要可直 接从公司购买合适的载体,也可以自己构建。  3)连接:目的DNA片段和适当载体的连接,一般 采用核酸内切酶分别消化DNA片段和载体,使它们 的末端能够连接到一起构成重组DNA分子。由于所 用内切酶的切割特点不同,产生三种连接方式:粘 端连接、平端连接和不相配的连接。 (4)转化:将连接的重组DNA产物导入合适的宿主 细胞,使其在宿主细胞内复制扩增或表达,赋予宿 主细胞新的生物特征 5)克隆化:重组DNA分子转化大肠杆菌后,在平 板培养基上筛选出单个菌落,此菌落经过酶切鉴定 或杂交实验后确定为含重组DNA分子的单克隆。  隆体 DNA克隆 DNA克隆的技术路线大致 包括以下几个程序:①分离制 克款体DL连 备侍克隆的DNA片段(目的 DNA)。②选择合适的载体。 ③在体外连接目的DNA和载体 ④4将重组DNA分子转入宿主细 胞,并筛选和鉴定