抗虫彩叶基因聚合表达载体构建及在毛白杨中的转化研究.pdfVIP

摘要 摘要 毛白杨生长迅速，树干通直挺拔，是我国重要的速生用材树种和园林绿化树种， 在我国林业经济、生态建设和城乡绿化中发挥着重要的作用。但病虫危害严重影响毛 白杨的正常生长，而叶色单一在一定程度上影响了毛白杨的观赏度。随着生物技术的 发展，利用多基因聚合转化技术创制同时具有抗虫和彩叶特性的毛白杨新材料，对于 毛白杨种质创新具有重要意义。BtcryII 基因编码的毒蛋白和丝氨酸蛋白酶抑制剂Bbi 基因对鳞翅目害虫具有高毒力，CmOr 基因可调控类胡萝 卜素含量以改变叶色，本实 验采用IRES 元件构建了多基因聚合表达载体pCAMBIA1304-BtcryII-IRES-CmOr- IRES-Luc；利用农杆菌介导法将其和抗虫基因表达载体pCAMBIA1304-Bbi 分别转入 毛白杨TC1521无性系中，通过抗性筛选、PCR 鉴定获得一批转基因阳性植株；进一 步通过RT-PCR、qRT-PCR 对外源基因的表达情况进行了分析，为后续进行抗虫试验、 叶片色素测试等生理生化指标分析奠定了工作基础。本研究主要结果如下： 1. 以pCAMBIA1304 质粒为骨架，构建了基于IRES元件的多基因聚合表达载体 pCAMBIA1304-BtcryII-IRES-CmOr-IRES-Luc，通过PCR 检测，证明外源基因BtcryII 和CmOr 已经成功整合到表达载体上。 2. 利用冻融法将多基因表达载体pCAMBIA1304-BtcryII-IRES-CmOr-IRES-Luc 和抗虫基因表达载体pCAMBIA1304-Bbi 导入农杆菌GV3101 中，通过农杆菌介导法 TC1521 Hyg 40 将其分别转入毛白杨 ，经过植物组织培养和潮霉素 （ ）筛选，得到 株 18 Bbi PCR 转抗虫、彩叶双价基因的生根抗性苗和 株转 基因的生根抗性苗。经 鉴定， 获得双价基因阳性植株8株和抗虫基因Bbi 阳性植株7株。 3. RT-PCR qRT-PCR 8 采用 和 技术，对 个转双价基因的阳性植株进行外源基因 的表达分析，检测结果表明，在其中7个转基因株系中都能够检测到BtcryII 和CmOr 基因，且相对表达量明显高于野生型植株 （WT）；对7个转Bbi基因阳性植株进行 RT-PCR 2 Bbi 检测，在 个转基因株系中检测到该基因的转录本，说明 基因不仅已经 整合到毛白杨TC1521的基因组中，而且能够正常转录。 4. 7 BtcryII CmOr 2 Bbi 对上述 个转 、 双价基因株系和 个转 抗虫基因株系进行扩 繁，共获得转双价基因植株24 株，转Bbi抗虫基因植株16株，并移栽到温室进行培 养。这些工作为后续抗虫测试和叶片色素分析奠定了工作基础。 I 摘要 关键词：毛白杨，BtcryII，CmOr，Bbi，遗传转化，抗虫，彩叶 II 目录 目录 1引言 1 1.1研究背景1 1.2 抗虫转基因研究进展1