日本落叶松C5F和DHN基因功能分析.pdfVIP

摘要 摘要 咖啡酰莽草酸酯酶（CSE ）作为木质素单体生物合成重要酶之一，可通过调控 木质素的合成来应对非生物胁迫。脱水素蛋白 （DHN ）是在脱水应激过程中过表 达的亲水性蛋白，是参与抗逆胁迫的蛋白，与植物脱水的保护机制有关。本论文 主要研究是日本落叶松（Larix kaempferi ）CSE 和DHN 基因的功能。 根据北美落叶松（Larix laricina ）转录组数据，成功从日本落叶松茎中克隆得 到了1 条CSE 基因和4 条DHN 基因，分别为LkCSE 、LkDHN1 、LkDHN2 、LkDHN3 和LkDHN4 。同源性序列比对和系统进化树表明LkCSE 很有可能具有催化活性， 并且CSE 可能存在于被子植物和裸子植物分化之前，但大多数单子叶植物在进化 过程中丢失了；LkDHN1 、LkDHN2 、LkDHN3 和LkDHN4 均属于SK3 型脱水素蛋 白并可能具有抗逆性。通过烟草瞬时表达技术发现LkCSE 蛋白的亚细胞定位为内 质网和质膜，LkDHN 蛋白的亚细胞定位主要在细胞核。利用原核载体和亲和层析 技术成功表达纯化获得LkCSE、LkDHN 、缺失K 段的LkDHN△K 和缺失S 段的 LkDHN△S 突变蛋白。通过高效液相色谱法技术开展了日本落叶松LkCSE 的酶学 性质研究，结果表明LkCSE 具有咖啡酰莽草酸酯酶的催化能力，可以水解咖啡酰 莽草酸生成咖啡酸与莽草酸；LkCSE 蛋白最适反应温度和pH 分别为30℃和6.0； -1 LkCSE 的K 值为82.08 μM，V 为13.04 nM min 。通过凝胶阻滞实验结果显示 m max 了LkDHN 蛋白可以与DNA 非特异性结合，可能具有保护或修复DNA 的功能； 缺失K 段的LkDHN△K 与DNA 的结合能力几乎消失了，表明K 段在DHN 与 DNA 互作中起到重要作用。本论文为日本落叶松CSE 和DHN 的进一步抗逆性研 究提供了参考。 关键词：咖啡酰莽草酸酯酶 （CSE ），脱水素蛋白 （DHN ），日本落叶松 （Larix kaempferi ），酶学功能，凝胶阻滞实验（EMSA ） I 目录 目录 摘要 I ABSTRACT II 1 引言 1 1.1 本研究的目的及意义 1 1.2 植物响应非生物胁迫的方式 1 1.3 木质素生物合成与植物逆境适应的关系 1 1.3.1 木质素在植物重金属离子胁迫中的作用 2 1.3.2 木质素在高温和低温胁迫中的作用 2 1.3.3 木质素在植物干旱和盐胁迫中的作用 3 1.3.4 CSE 功能概述及抗逆性研究进展 3 1.4 DHN 的概述及功能 4 1.4.1 LEA 蛋白的概述 4 1.4.2 DHN 的概述 5 1.4.3 DHN 的不同保守片段 6 1.4.4 DHN 的功能 6 1.5 技术路线 8 2 落叶松CSE 与DHN 基因克隆与生物信息学分析 9 2.1 实验材料、试剂与设备 9 2.1. 1 实验材料 9 2.1.2 试剂与耗材 9 2.1.3 溶液配制 9 2.1.4 仪器设备 10 2.2 实验方法 10 2.2.1 落叶松CSE 与DHN 基因克隆与鉴定 10 2.2.2 落叶松CSE 和DHN 基因的生物信息学分析 14 2.3 结果与分析 14 2.3.1 北美落叶松转录组本