PCR实验室建立及预防污染.pptVIP

什么是PCR反应？ ?聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 PCR检测原理 PCR反应的特点 高度特异性 高度敏感性 高丰度产量 临床基因扩增检验实验室区域设置原则 试剂储存和准备区 标本制备区 扩增反应混合物配制和扩增区 扩增产物分析区 如使用全自动分析仪，区域可适当合并。 进入各工作区域必须严格按照单一方向进行，即试剂储存和准备区===标本制备区 ===扩增反应混合物配制和扩增===扩增产物分析区。 试剂储存和准备区 2-8C和-20C冰箱 混匀器 微量加样器（覆盖1-1000ul） 移动紫外灯（近工作台面） 消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心） 专用工作服和工作鞋 专用办公用品 标本制备区 2-8C冰箱、-20C或-80C冰箱 高速台式冷冻离心机 混匀器 水浴箱或加热模块 微量加样器（覆盖1-1000ul） 可移动紫外灯（近工作台面） 超净工作台 消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心） 专用工作服和工作鞋 专用办公用品 扩增反应混合物配制和扩增区 核酸扩增仪 微量加样器（覆盖1-1000ul） 可移动紫外灯（近工作台面） 消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心） 专用工作服和工作鞋 专用办公用品 扩增产物分析区 视检验方法不同而定。基本仪器设备如下：1、 微量加样器（覆盖1-1000ul）2、 可移动紫外灯（近工作台面）3、 消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、加样器吸头（带滤心）4、 专用工作服和工作鞋5、 专用办公用品 PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。 污染原因 (一) 标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。　　 污染原因 　(二) PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染. 污染原因 (三) PCR扩增产物污染: 这是PCR反应中最主要最常见的污染问题，因为PCR产物拷贝量 大，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性。 污染原因 还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由 其造成的污染是一个值得特别重视的问题. 防止污染的方法 (一) 合理分隔实验室: 将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开。最好能划分①标本处理区;②PCR反应液制备区;③PCR循环扩增区;④PCR产物鉴定区。其实验用品及吸样枪应专用，实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA。 (二) 吸样枪: 吸样枪污染是一个值得注意的问题。由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。 (三) 预混和分装PCR试剂:所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先配制好，然后小量分装，-20℃保存。以减少重复加样次数，避免污染机会。另外，PCR试剂，PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。 (四) 防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用。 (五) 设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照。 (六) 选择质量好的Eppendorf管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出。 PCR实验室的建立及如何预防污染的发生