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个人收集整理 仅供参考学习 Southern Blot 实验流程（包括原理 /细节） 一、DNA 的提取 人和哺乳动物细胞基因组 DNA 的分离通常是在有 EDTA 、Sarkosye 等一 类去污剂 存在下，用 蛋白酶 K 消化细胞，随后用 酚、氯仿 抽提，经 RNase 处理和纯化 来 提取 DNA 。 (1) 取单层细胞，经无钙、镁 PBS 洗一次，用 0.25% 胰 蛋白酶 消化，细胞悬液经 PBS 洗 2 次, 弃上清，取细胞沉淀。 (2) 加入 2ml 细胞裂解液 (10mM Tris HCL ，pH8.0 ，0.1mol/L EDTA ，10mmol/L NaCL ，1% SDS )充分混匀，加入蛋白酶 K 至终浓度为 0.5 ～ 1g/L 、Sarkosye 终浓度为 0.5% ，混匀 裂 解蛋白呈糊状。 (3)50 ℃水浴 2h ，转入 37 ℃水浴 过夜，次日加入等体积饱和酚，轻轻颠倒混匀，以 防止 DN A 断裂 ，约 3min 。 12000r/min 离心 15 分钟（室温） (4) 取水相，再加入等体积酚 / 氯仿 (1:1), 同样颠倒混匀， 去除蛋白质 12000 r/min 离心 15 分 钟（室温） (5) 再重复步骤 (4) ，再用等体积酚 /氯仿 (1:1) 抽提一次 (6) 取水相，再加入等体积氯仿，去除酚及蛋白质，颠倒混匀 12000 r/min 离心 15 分钟（室温） (7) 取水相，加入 2 倍体积的预冷无水乙醇， 沉淀 DNA ，混匀 -20 ℃放置 1 小时 12000 r/min 离心 15 分钟（室温） (8) 用 70% 乙醇洗涤一次，按上法离心将沉淀真空干燥 10 分钟。 (9) 加入 RNase A 至终浓度 100mg/L ，37 ℃水浴消化 1 小时， 消化污染的 RNA 。 (10) 加入蛋白酶 K 至终浓度 0.4g/L 、Sarkosye 至终浓度 0.5% ，混匀， 50 ℃水浴 2 小时， 加入 NaAC 至终浓度 10mmol/L 。 (11) 用等体积饱和酚各抽提一次，步骤同前。 (12) 吸上清，加入氯仿 / 异戊醇 (24:1) ，按上法 1 / 8 个人收集整理 仅供参考学习 再抽一次。 (13) 取水相，加入 2 倍体积预冷无水乙醇， -20 ℃ 1 小时。 (14) 取沉淀用 70% 乙醇洗一次， 真空干燥 10 分钟后溶于少量 TE 中，4 ℃贮存。 个人收集整理 勿做商业用途 Southern 对 DNA 的质量要求比较高，一般来说， 高质量 DNA 样品需具备以下几点：① DNA 完整性好； ② DNA 纯度高； ③勿用 TE 溶解 DNA ；④ DNA 浓度不低于 0.7ug/ul ， 杂交需模板 DNA 约 20ug/ 泳道 /次 二、引物设计三、 DNA 检测 个人收集整理 勿做商业用途 1、DNA 浓度的测定 DNA 浓度用紫外 分光光度计 测定，核酸的光吸收值位于波长 260nm 处，蛋白质则位于 28 0nm ，分别测定后，其 OD260/OD280 的比值应大于 1.8. 低于此值，说明 DNA 中仍残留较 多的蛋白质，此时可用酚、氯仿继续抽提纯化。若比值大于 1.9 表明 DNA 链破坏，断裂严 重，已成为小分子，因此操作应轻柔。取少许 DNA 溶液，经紫外线扫描，吸