小鼠皮肤组织HE染色免疫荧光染色.docxVIP

实验方案 小鼠皮肤组织 HE 染色和免疫荧光染色 HE 染色 一 试剂及耗材 小鼠皮肤细胞，固定液（ 4%多聚甲醛）， PBS,不同浓度乙醇，透明剂（二甲苯） ， 石蜡，包埋盒，苏木精伊红染色液，中性树胶等 二 实验步骤 1. 取小鼠皮肤组织去毛处理成合适的大小并置 PBS或生理盐水中充分漂洗残余 血液 将漂洗干净的组织放入 4%多聚甲醛中（ 1:5 的比例浸泡）固定过夜 将固定好的组织用 PBS清洗两遍，每次 30min 组织脱水： 30%乙醇→ 50%乙醇→ 75%乙醇（可 4℃过夜）→ 85%乙醇→ 95%乙醇 → 100%乙醇（各 30min） 透明：二甲苯透明 3× 20min（具体时间根据透明程度来设定， 小鼠皮肤 10min 即透明，透明时如发现组织有部分白雾状，则可能是脱水未脱净） 浸蜡： 4× 30min（每 30min 换一次蜡，换四次以使石蜡浸入组织起支持作用） 包埋（注意组织摆放及横切， 纵切，记录标签），待石蜡充分凝固即可修片 ( 刚包埋好的热蜡块不能立即冷冻 ) 切片（ 5-7um），摊片（ 40-45 ℃），烘片（ 62℃左右，充分烘干） 9.HE 染色：二甲苯Ⅰ (10min) →二甲苯Ⅱ (5min) →二甲苯 : 乙醇 =1:1(2min) → 100%乙醇→ 95%乙醇 (2min) → 85%乙醇 (1min) → 70%乙醇 (1min) → 50%乙醇 (1min) →水 (1min) →苏木精染液 (1min) →流动自来水 (3min) → 50%乙醇 (1min) → 70%乙 醇 (1min) → 85%乙醇 (1min) → 95%乙醇 (1min) →伊红染液 (1min) → 95%乙醇 (1min) 100%乙醇 (1min) → 100%乙醇 (1min) →二甲苯Ⅰ (2min) →二甲苯Ⅱ (2min) 中性树胶封片 ( 注意材料上的二甲苯不能干，尽量避免出现气泡) 显微镜观察 实验样品 实验编号 实验时间 实验动物年 实验动物性 取组织部位 龄 别 A 8 周 母 耳朵 B 4 周 公 腹部 C 4 周 公 背部 四 实验结果 免疫荧光染色 一 试剂及耗材 小鼠皮肤细胞石蜡切片，山羊血清，一抗，二抗， 0.3%Triton x100 ，PBS等 二 实验步骤 石蜡切片 60℃烘片 1 小时 脱蜡到水 : 二甲苯Ⅰ (10min) →二甲苯Ⅱ (5min) →二甲苯 : 乙醇 =1:1(2min) → 100%乙醇→ 95%乙醇 (2min) →85%乙醇 (1min) → 70%乙醇 (1min) → 50%乙醇 (1min) → 水 (1min) 蒸馏水洗 1min 抗原修复：切片置于 0.1mol/L 且 ph=6.0 的柠檬酸钠修复液中，在水浴锅内 （ 99℃）持续放 10-15min ，自然冷却 20-30 分钟（不能将切片拿出冷却） 5. 去除内源性酶： 3%H2O2室温孵育 5-10min 6.PBS 洗 2-3 次，每次 5min 0.3%Triton x100 室温孵育 20min（增加细胞膜通透性） 于室温湿盒内非特异血清封闭 1h,( 用 DPBS稀释含 10% goat FBS) 孵育一抗 (ITGB1)4 ℃过夜或 37℃1h（一抗： DPBS(10%goat FBS)=1:200 ） , 注意 做空白对照（不加一抗，用 DPBS(10% goat FBS)孵育） 孵育完成后 PBS洗 3 次，每次 5min 滴加荧光二抗（ IgG-FITC ：DPBS(10% goat FBS)=1:200 ）室温置湿盒中避光孵 育 2 小时或 37℃ 30min ，用 PBS3 分钟×3 次洗去二抗，用滤纸擦去标本外的 PBS 滴加 DAPI 避光孵育 2 分钟（染核）。用 PBS1 分钟×3 次洗去 DAPI，用滤纸擦去标本外的 PBS 最后用含 10%甘油 PBS封片，并在荧光显微镜下立即观察 备注： 0.1mol/L 柠檬酸钠 PH6.0( 柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g 加入 1000ml 蒸馏 水中 )