PCR 关键技术的种类及其应用.docVIP

PCR 技术种类及其应用 1 PCR 技术基础原理 PCR 技术是在模板DNA、引物和四种dNTP等存在条件下, 依靠于DNA聚合酶(T aq 酶)酶促合成反应。其具体反应分三步：变性、退火、聚合。以上三步为一个循环， 每一循环产物DNA又能够作为下一个循环模板，数小时后，介于两个引物之间目标DNA得到了大量复制，经25～30次循环DNA数量可达2×106～7拷贝数。 2　PCR技术种类 2.1 反向PCR( Inverse PCR, IPCR)技术 原理：反向PCR是克隆已知序列旁侧序列一个方法．关键原理是用一个在已知序列中无切点限制性内切酶消化基因组I)NA．后酶切片段本身环化．以环化DNA作为模板，用一对和已知序列两端特异性结合引物，扩增夹在中间未知序列。该扩增产物是线性DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA序列内部酶切位点分布情况。用不一样限制性内切酶消化，能够得到大小不一样模板DNA，再经过反向PCR取得未知片段 。 该方法不足是：①需要从很多酶中选择限制酶，或说必需选择一个适宜酶进行酶切才能得到合理大小DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。②大多数有核基因组含有大量中度和高度反复序列，而在YAC或Cosmid中未知功效序列中有时也会有这些序列，这么，经过反向PCR得到探针就有可能和多个基因序列杂交。 2.2　锚定PCR(Anchored PCR, APCR)技术 用酶法在一通用引物反转录cDNA3’-末端加上一段已知序列, 然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增, 称为APCR。 应用：它可用于扩增未知或全知序列, 如未知cDNA制备及低丰度cDNA文库构建。 2.3　不对称PCR(asymmetric PCR)技术 两种引物浓度百分比相差较大PCR技术称不对称PCR。在扩增循环中引入不一样引物浓度, 常见50～100÷1百分比。在最初10～15个循环中关键产物还是双链DNA, 但当低浓度引物被消耗尽后, 高浓度引物介导PCR反应就会产生大量单链DNA。 应用：可制备单链DNA片段用于序列分析或核酸杂交探针。 2.4　反转录PCR(reverse transcription, RT- PCR)技术 当扩增模板为RNA时, 需先经过反转录酶将其反转录为cDNA才能进行扩增。RT - PCR应用很广泛, 不管是分子生物学还是临床检验等全部常常采取。 2.5　修饰引物PCR技术 为达成一些特殊应用目标, 如定向克隆、定点突变、体外转录及序列分析等, 可在引物5’-端加上酶切位点、突变序列、转录开启子及序列分析结合位点等 。 2.6　巢式PCR(NEST PCR)技术 先用一对靶序列外引物扩增以提升模板量, 然后再用一对内引物扩增以得到特异PCR带, 此为巢式PCR。若用一条外引物作内引物则称之为半巢式PCR。为降低巢式PCR操作步骤可将外引物设计得比内引物长些, 且用量较少, 同时在第一次PCR时采取较高退火温度而第二次采取较低退火温度, 这么在第一次PCR时, 因为较高退火温度下内引物不能和模板结合, 故只有外引物扩增产物, 经过若干次循环, 待外引物基础消耗尽, 无需取出第一次PCR产物, 只需降低退火即可直接进行PCR扩增。这不仅降低操作步骤, 同时也降低了交叉污染机会。这种PCR称中途进退式PCR( drop-in, drop-out PCR)。上述三种方法关键用于极少许DNA模板扩增。 2.7　等位基因特异性PCR(Allele- specificPCR, ASPCR)技术 ASPCR依靠于引物3’- 端一个碱基错配,不仅降低多聚酶延伸效率,而且降低引物-模板复合物热稳定性。这么有点突变模板进行PCR扩增后检测不到扩增产物,可用于检测基因点突变。 2.8　单链构型多态性PCR(single- strandconformational polymorphism PCR, SSCPPCR)技术 SSCP- PCR是依据形成不一样构象等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳迁移率改变来检测基因变异。在不含变性剂中性聚丙烯酰胺凝胶中,单链DNA迁移率除和DNA长度相关外,更关键取决于DNA单链所形成空间构象, 相同长度单链DNA因其次序不一样或单个碱基差异所形成构象就会不一样,PCR产物经变性后进行单链DNA凝胶电泳时, 每条单链处于一定位置,靶DNA中若发生碱基缺失、插入或单个碱基置换时,就会出现泳动变位,从而提醒该片段有基因变异存在。 2. 9　低严格单链特异性引物PCR (Lowstringencysingle specific primer PCR, LSSP- PCR)技术 LSSP - PCR 是建立在PCR 基础上又一个新型基因突变检测技术。要求是“二高一低”,