蛋白酶活性 的测定.docVIP

实验四　蛋白酶活力得测定 一、实验目得 ?１、了解蛋白酶活力测定得原理; ?2、掌握蛋白酶活力测定得方法。 ? 二、实验原理 蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中得肽键,也能够水解酰胺键与酯键,因此可用蛋白质或人工合成得酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶得活力。 本实验选用酪蛋白为底物,测定微生物蛋白酶水解肽键得活力。酪蛋白经蛋白酶作用后,降解成相对分子质量较小得肽与氨基酸,在反应混合物中加入三氯醋酸溶液,相对分子质量较大得蛋白质与肽就沉淀下来,相对分子质量较小得肽与氨基酸仍留在溶液中,溶解于三氯醋酸溶液中得肽得数量正比于酶得数量与反应时间。在２80nm波长下测定溶液吸光度得增加,就可计算酶得活力。 ? 三、实验试剂 ①?微生物蛋白酶萃取液(0.01g/ml):称取1。0g酶制剂,加１00ml蒸馏水搅拌30miｎ,在４℃下离心分离后,将上层清夜置于冰箱中保存,使用前稀释一定倍数; ②?0。０2ｍol/Ｌ磷酸盐缓冲液(pH7。5); ③?1%酪蛋白溶液:取1、0g酪蛋白,加1０0mｌ?０。2ｍｏl/L磷酸盐缓冲液(PH7、5),加热并搅拌使它完全分散,然后置于冰箱中保存; ④?5%三氯醋酸(TＣＡ)溶液、 四、实验步骤 1、将５%TＣＡ溶液与１%酪蛋白溶液在37℃下保温。 2、取四支15ml具塞试管,分别标上记号Ａ1、Ａ0、B１与Ｂ0。在A1与Ａ０试管中各吸入0.20ml酶液,在