上海交大医学院细胞生物学关键技术考试重点.docxVIP

显微镜技术 分辨率（resolution）：用于表示人眼和仪器，能够分辨两点之间最小距离标志，是衡量显微镜性能关键指标。 人眼分辨率由人眼生理结构决定。光镜由光波波长和物镜数值孔径决定。电镜由电子束半波长决定。分辨率极限：人眼（0.1mm）；光镜（0.2μm）；电镜（0.2nm）。 显微镜技术优化关键是提升分辨率，表现在两个方面：（1）光源采取（2）样品制备和信号展现方法使信噪比提升。 显微镜分类： 光学显微镜：一般光学显微镜；荧光显微镜（激光扫描共聚焦显微镜、超高分辨率荧光显微镜、活细胞荧光工作站）；相差显微镜：观察活细胞；微分干涉相差显微镜（DIC）：活细胞三维立体投影影像 电子显微镜：透射电子显微镜（TEM）；扫描电子显微镜（SEM）；分析电子显微镜；高压电子显微镜；冷冻电子显微镜 扫描探针显微镜：原子力显微镜 一般光学显微镜关键三部分：聚光镜、物镜、目镜；光源：可见光 样品制备5步：固定（甲醛）；脱水（乙醇）；包埋（石蜡）；冰冻切片（1-10μm）；苏木精伊红染色（HE染色） 荧光显微镜光源：高压汞灯、弧光灯 荧光起源：（1）细胞和组织自发荧光（2）外源导入荧光蛋白：动态检测、活体检测、长时间检测、轻易融合（3）荧光染料：吖啶橙染色DNA（绿）、RNA（橙）（4）荧光标识抗体：荧光染料和抗体共价结合（5）荧光探针：金属离子探针、细胞内pH值~、细胞内活性氧~、线粒体跨膜电位~。 5、荧光素（Fluorphore）：吸收能量后含有发光现象物质，通常为吸收短波长能量后发散出长波长光，并随照射停止而消失。荧光素发射光减弱（光漂白）或消失（淬灭）。 6、激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）：以激光作为激发光源，采取光源针孔和检测针孔共聚焦技术，对样本进行断层扫描，以取得高分辨率光学切片荧光显微镜系统。 7、简述激光扫描共聚焦显微镜原理（光源点,物点,像点，三点共轭） 以激光作为激发光源；结构上采取双针孔装置，形成物像共聚焦独特设计；激光经过聚光镜焦平面上针孔形成点光源，再经物镜在焦平面对样品逐点扫描。样品上每个照射点经反射镜在像焦平面探测针孔处成像，被光电倍增管探测器接收，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清楚整个焦平面共聚焦图像。 激光扫描共聚焦显微镜功效： （1）薄层断层扫描（光学切片） （2）多通道同时扫描：激光共聚焦显微镜能够多激光多通道同时扫描 （3）ZOOM成像：在不变换镜头情况下，对某幅图片局部放大，并进行精细逐点扫描成像，取得高分辨率图像。 （4）多维度扫描：Z轴扫描（垂直）或T扫描（时间） （5）荧光定量分析 9、激光扫描共聚焦显微镜技术在医学及生物学研究中应用 （1）静态：分子定位、定量分析、分子间相互作用 （2）动态：分子或细胞活动动态改变：蛋白质移位；蛋白质相互作用研究（FRET) ；分子运动测量(FRAP)；离子浓度改变趋势检测 10、简述激光扫描共焦显微镜和荧光显微镜差异。LSCM优缺点。 类别 LSCM 荧光显微镜 光源 激光（紫外光、可见光、近红外） 短波长光源（多为紫外光） 照明方法 点照明、逐点扫描 落射式 样本信号 焦平面样本信号，几乎无次级荧光干扰 可有多个平面样本信号，伴随相邻部位干扰 图像采集系统 荧光信号被PMT探测器接收实时观察，数字化图像，能够进行图像处理和定量分析 摄影机原理 LSCM优缺点： LSCM优点：（1）高水平分辨率：0.18μm（2）高垂直分辨率：沿Z轴逐层扫描（3）高灵敏度，信噪比良好（4）能定时、定位、定性、定量 缺点：（1）分辨率极限：0.15μm（2）观察厚度：50-100μm（3）逐点扫描，成像速度慢（4）伪彩色 11、LSCM和电子显微镜区分 激光共聚焦显微镜 电子显微镜 工作原理 光波透射 电子透射 成像效果 微米级（荧光标识） 纳米级 研究目标 观察分布、表示量 观察细微结构 12、超高分辨率荧光显微镜原理：“突破”衍射极限，提升分辨率（50nm） （1）基于点扩展函数调制：点扩展函数变小 （2）基于随机单分子定位：不会有两个靠很近点同时亮起来 13、电子显微镜：以电子束为光源，电磁场为透镜，利用电子信号成像，含有高分辨率和放大倍数显微镜，用于研究组织和细胞超微结构。 14、电子束：又称电子射线，电子束带负电荷，含有光波动性、可折射性，电镜利用电子束作为“光源” 成像。 15、透射电子：当样品厚度小于 100nm 时，部分电子可穿透样品，将穿透样品电子叫做透射电子,利用透射电子信息成像称为透射电镜。 16、二次电子：在入射电子轰击下,样品表面 5-50 nm 深度激发出来电子称为二次电子，利用二次电子信息成像称为扫描电镜。 17、TEM成像和工作原理： （1）电子束投射在样品上，部分电子直接穿透样品产生透