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FOXL2 对鸡颗粒细胞胶原蛋白基因COL4A1的表达调控研究 目 录 摘 要i ABSTRACTiii 缩略词表 （ABBREVIATIONS）vi 1 前言1 1.1 研究问题的由来1 1.2 文献综述2 1.2.1 卵巢和卵泡发育2 1.2.2 颗粒细胞对卵泡发育的作用3 1.2.3FOXL2 对卵巢发育的作用3 1.2.4 细胞外基质4 1.2.5 胶原蛋白6 1.3研究目的及意义10 1.4 研究技术路线10 2 材料与方法11 2.1 试验材料11 2.2 主要仪器、试剂和溶液配制11 2.2.1 主要仪器与设备11 2.2.2 主要试剂和试剂盒11 2.3 试验方法13 2.3.1 颗粒细胞的制取及原代培养13 2.3.2 免疫荧光鉴定前体颗粒细胞14 2.3.3 在鸡卵泡颗粒细胞及成纤维细胞中超表达FOXL215 2.3.4 胶原蛋白的ELISA 检测15 2.3.5 细胞总 RNA 的提取和反转录16 2.3.6qPCR18 I 华中农业大学2020 届硕士研究生学位 （毕业）论文 2.3.7 蛋白印迹 （Western Blot）20 2.3.8 双荧光素酶报告实验23 2.3.9ChIP-qPCR27 3 结果与分析31 3.1前体颗粒细胞的分离与鉴定31 3.2 不同发育阶段卵泡颗粒细胞培养32 3.3 超表达FOXL2 对细胞中胶原蛋白总量的影响32 3.4FOXL2 对细胞中不同胶原蛋白基因表达的影响33 3.4.1不同胶原基因引物的检测33 3.4.2RNA 质量检测和cDNA 检测34 3.4.3qPCR35 3.5 FOXL2 COL4A1 超表达 对 蛋白表达的影响 37 3.6双荧光素酶报告基因检测38 3.6.1COL4A1 启动子双荧光素酶报告基因载体构建38 3.6.2FOXL2 对COL4A1 启动子活性的影响38 3.7ChIP-qPCR39 3.7.1 含HA 标签蛋白的超表达FOXL2 载体的构建39 3.7.2 载体验证及超声波效率检测40 3.7.3qPCR42 4 讨论44 4.1FOXL2 对鸡卵泡颗粒细胞中胶原蛋白基因的影响44 4.2FOXL2 COL4A1 对 的调控 45 4.3FOXL2 调控基底膜对卵泡发育的影响45 5 小结48 5.1 本研究的结果48 5.2 本研究的创新点48 5.3 下一步计划48 参考文献49 II FOXL2 对鸡颗粒细胞胶原蛋白基因COL4A1的表达调控研究 致谢55 III FOXL2 对鸡颗粒细胞胶原蛋白基因COL4A1的表达调控研究 摘 要 FOXL2 是叉头状转录因子超家族的成员之一，特异性表达于卵巢颗粒细胞，对 卵泡的发育至关重要。本实验室在鸡卵巢颗粒细胞中改变FOXL2表达水平后的RNA 测序中发现，FOXL2