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米尔伊丽莎白菌快速分子检测方法的建立与应用 目 录 摘 要i Abstractiii 第一章 文献综述1 1 伊丽莎白菌研究概况1 1.1 伊丽莎白菌的分类地位1 1.2 伊丽莎白菌的生物学特性3 1.3 伊丽莎白菌感染的流行病学3 1.4 伊丽莎白菌感染的临床症状4 1.5 伊丽莎白菌感染的病理变化5 1.6 伊丽莎白菌的致病机理5 1.7 伊丽莎白菌感染的治疗6 1.8 伊丽莎白菌的分离鉴定6 1.8.1 生理生化鉴定方法6 1.8.2 细菌鉴定系统7 1.8.3 16SrDNA 序列分析8 1.9 伊丽莎白菌检测方法9 1.9.1PCR 检测技术9 1.9.2 荧光定量PCR 检测技术 10 2 本研究的目的及意义11 第二章 米尔伊丽莎白菌双重PCR 检测方法的建立 12 1 前言12 2 材料和方法12 2.1 实验材料12 2.1.1 菌株12 2.1.2 试剂和试剂盒13 2.1.3 仪器和设备14 2.2 实验方法14 2.2.1 实验菌株的活化和DNA 的提取14 2.2.2 双重PCR 靶基因选择及引物设计 15 2.2.3 双重PCR 条件优化 16 2.2.4 双重PCR 特异性检测 16 2.2.5 双重PCR 灵敏度检测 16 3 实验结果与分析17 3.1 双重PCR 条件优化 17 3.2 双重PCR 特异性检测20 3.3 双重PCR 灵敏度检测21 I 华中农业大学2020届硕士研究生学位论文 4 讨论22 第三章 米尔伊丽莎白菌荧光定量PCR 检测方法的建立24 1 前言24 2 材料和方法24 2.1 实验材料24 2.1.1 菌株24 2.1.2 试剂及试剂盒26 2.1.3 仪器和设备26 2.2 实验方法26 2.2.1 检测靶点的筛选与引物设计26 2.2.2 实验菌株的活化和DNA 的提取27 2.2.3 荧光定量PCR 标准品的制备27 2.2.4 荧光定量PCR 扩增条件优化30 2.2.5 荧光定量PCR 标准曲线的构建30 2.2.6 荧光定量PCR 特异性检测30 2.2.7 荧光定量PCR 重复性检测30 2.2.8 荧光定量与普通PCR 的灵敏性和特异性比较31 3 实验结果与分析31 3.1 扩增条件优化31 3.2 标准曲线的构建32 3.3 特异性检测32 3.4 重复性检测33 3.5 荧光定量与普通PCR 灵敏性和特异性比较34 4 讨论36 第四章 双重PCR 和荧光定量PCR 检测方法的应用38 1 前言38 2 材料和方法38 2.1 实验材料38 2.1.1 菌株38 2.1.2 病料来源38 2.1.3 试剂及试剂盒38 2.1.4 仪器和设备39 2.2 实验方法39 2.2.1 双重PCR 检测39 2.2.2 荧光定量