副猪嗜血杆菌唾液酸酶诱导3D4_21细胞炎症反应的机制研究.pdfVIP

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2021-01-11 发布于江苏
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副猪嗜血杆菌唾液酸酶诱导3D4_21细胞炎症反应的机制研究.pdf

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副猪嗜血杆菌唾液酸酶诱导3D4/21 细胞炎症反应的作用机制研究目录摘要i Abstract iii 缩略语表(Abbreviation) vi 1 前言 1 1.1 副猪嗜血杆菌 1 1.1.1 病原学与流行病学 1 1.1.2 副猪嗜血杆菌致病机制2 1.2 唾液酸3 1.3 唾液酸酶5 1.4 Siglecs 7 2 目的与意义 10 3 材料与方法 11 3.1 实验材料 11 3.1.1 菌株、载体、细胞 11 3.1.2 试剂和试剂盒 12 3.1.3 主要溶液的配制 13 3.1.4 仪器与设备 15 3.1.5 设计引物 17 3.2 试验方法 19 3.2.1 pK18-nHUKD 重组质粒的构建 19 3.2.2 ΔnanH::kan 缺失株的构建22 3.2.3 互补菌株ΔnanH+pNanH 的构建23 3.2.4 NanH 蛋白的表达25 3.2.5 NanH 多克隆抗体的制备28 3.2.6 细菌的生长曲线测定29 3.2.7 细菌的形态学观察30 3.2.8 细菌唾液酸酶活性的检测30 3.2.9 细胞的培养31 3.2.10 流式细胞术检测3D4/21 细胞表面的去唾液酸化水平32 3.2.11 检测炎性细胞因子33 3.2.12 检测Siglecs 相关基因表达34 3.2.13 免疫共沉淀检测Siglec-5 是否结合SHP2 34 3.2.14 炎性信号通路的检测35 4 结果与分析37 4.1 三种不同副猪嗜血杆菌唾液酸酶活性的检测37 4.2 唾液酸酶的氨基酸序列分析37 I 华中农业大学2020 届硕士研究生学位论文 4.3 重组质粒的构建38 4.3.1 pK18-nHUKD 重组质粒的构建38 4.3.2 pSHG -nanH 互补质粒的构建39 3 4.4 ΔnanH::kan 基因缺失株及ΔnanH+pNanH 互补株的鉴定39 4.4.1 PCR 鉴定39 4.4.2 Western Blot 鉴定40 4.5 rNanH 蛋白的表达及多克隆抗体的制备41 4.5.1 rNanH 的SDS检测41 4.5.2 BCA 试剂盒测定蛋白浓度42 4.5.3 NanH 蛋白的多克隆抗体的制备42 4.6 菌株的生长曲线测定43 4.6.1 时间与OD600 对应的生长曲线43 4.6.2 OD600 与活菌量对应的生长曲线43 4.7 菌株的细菌形态鉴定44 4.8 唾液酸酶活性的检测45 4.9 3D4/21 细胞表面去唾液酸化的测定46 4.9.1 用细菌感染3D4/21 细胞，检测细胞表面的去唾液酸化46 4.9.2 用rNanH 刺激3D4/21 细胞，检测细胞表面的去唾液酸化47