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RNAi ：制备 siRNAs 的方法 越来越多的研究人员开始采用小分子干扰 RNA （ small interfering RNAs ，siRNAs) 来抑制特 定的哺乳动物基因表达。 siRNA 是一种短片断双链 RNA 分子，能够以同源互补序列的 mRNA 为靶目标降解特定的 mRNA ，这个过程就是 RNA 干扰途径（ RNA interference pathway ）。RNAi 的应用包括功能基因组学，药物靶筛选，细胞信号传导通路分析等等。 目前为止较为常用的 5 种制备 siRNAs 的方法包括 化学合成 体外转录 ? 长片断 dsRNAs 经 RNase III 类降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III) ? siRNA 表达载体或者病毒载体在细胞中表达 siRNAs PCR 制备的 siRNA 表达框在细胞中表达 前面 3 种方法包括体外制备 siRNAs 然后经过转染或者电转导入哺乳动物细胞后面两种方法 则依赖能够表达 siRNAs 的 DNA 载体或者表达框转染到细胞中。每种方法都有自己的优点和缺 点。哪种是最好的方法，其实取决于实验目的。这里简单介绍这 5 种方法，优点和缺点，以及 它们最适合的应用。 siRNA 的设计 除了方法 3 以外， 其他的方法都在制备 siRNA 前都需要单独设计 siRNA 序列。关于怎样设 计 siRNA 以及 siRNA 设计对 siRNA 功能的影响， 尽管我们不断掌握越来越多有关设计原则的信 息。但这仍然不是精确的。通常来说，每个目标序列设计 3 — 4 对 siRNAs ，在后面的实验中选 择最有效的那个。网上有提供免费的 siRNA 设计工具。 体外制备 1.化学合成 尽管化学合成是最贵的方法，  但是却是最方便的  —— 研究人员几乎不需要做什么工作。  包括 Ambion  和  Qiagen  公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成  siRNA  。主要的缺点包括价 格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成 siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。  3 — 4  对 最适用于： 已经找到最有效的 siRNA 的情况下，需要大量 siRNA 进行研究 不适用于： 筛选 siRNA 等长时间的研究，主要原因是价格因素 2.体外转录 通过体外转录的方法可以合成 siRNAs ，这样的成本相对化学合成法而言比较低，是一种性 价比高的筛选 siRNAs 的好方法。更重要的是采用这种方法能够比化学合成法更快的得到 siRNAs 。以 Silencer siRNA Construction Kit 为例，一旦得到 DNA Oligo 模版（这个还是需 要 DNA 合成的，不过 DNA 合成的成本就比较低了），只要 24 小时就可以，不需要等很久。这 个方法的不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的 siRNAs ，但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比，还是需要占用研究人员 相当的时间 —— 毕竟， 化学合成只需要定购就可以了。 值得一提的是体外转录得到的siRNAs 只 要较低的浓度就可以达到化学合成 siRNAs 较高浓度得到的效果 （ 0.5-20 nM vs. 50-100 nM per transfection ，图 2 ） 最适用于： 筛选 siRNAs ，特别是需要制备多种 siRNAs ，化学合成的价格成为障碍时。 不适用于： 实验需要大量的，一个特定的 siRNA 。长期研究。 Figure 2. Use of Chemically Synthesized and in Vitro Transcribed siRNAs to Induce Gene Silencing. siRNAs targeting ? -Actin were prepared by chemical synthesis (Ambion) or by in vitro transcription using Ambions Silencer? siRNA Construction Kit. HeLa cells were plated at 30,000 cells per well in a 24 well tissue culture plate containing glass slides. The cells were tran sfected 24 hours after plating, using 2 μ l siPORT? Li