第二章基因工程的工具酶(13).pptVIP

八. 酶切反应的操作 ◆大部分II型限制性核酸内切酶需要相似反应条件： Tris-HCl 50mmol/L pH7.5 MgCl2 10mmol/L NaCl 0-100mmol/L DTT 1mmol/L Volume 20-100μL Temperature 37℃ Time 1-1.5h ◆ 1个单位限制性核酸内切酶：在建议使用的缓冲液及温度下，在20μL反应液中反应1h，使1μg标准DNA完全消化所需的酶量。 buffer HMKL ？？？ ＋ － 电泳 紫外分析 37℃ 1h 加反应液 CK M Buffer (10X) 2.0 ?L （总体积决定） Water 16.5 ?L （可变） DNA 1.0 ?L or 1.0 ? g （可变） Enzyme 0.5 -1.0 ?L Volume 20.0 ?L 1.0kb 1.0kb 0.4kb 0.5kb 0.6kb CK M T T 八. 酶切反应的操作 对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切。 对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法： 使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解。 低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切。 一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切。 0.1倍体积的 5 M NaAc pH 5.4； 2.5倍体积的冰冷乙醇； 冰浴 5 分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥； 九. 联合酶解（双酶切） 十. 影响限制性核酸内切酶活性的因素 ①DNA样品的纯度 DNA样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、 SDS、 EDTA、NaCl等,都有可能抑制酶活性。 可采用以下方法，提高酶活性： 加大酶的用量，1μg DNA用10U酶 加大反应总体积 延长反应时间 十. 影响限制性核酸内切酶活性的因素 ② DNA样品的甲基化程度 大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5′CCAGG 3′或5′CCTGG3′序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoR II等，但Bgl I、Kpn I不受影响。 采用去甲基化酶的E. coli菌株来制备质粒DNA，可防止DNA的甲基化。 十. 影响限制性核酸内切酶活性的因素 ③ 酶切反应的温度 多数标准反应温度是37℃，如Sma I为25℃或30℃，Sfi I为50℃ 。 反应温度过度或过低都会影响酶活性，甚至导致酶失活。 ④ DNA分子结构 某些酶切割超螺旋质粒DNA时，酶量比切割线性DNA时高出许多倍，最高可达20倍。 第二章 基因工程的工具酶(13) 二. 寄主的限制和修饰现象 限制(Restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制性内切酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。 限制作用:实际就是限制性内切酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。 修饰(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰,从而免遭自身限制性酶的破坏。 修饰作用:宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。 1）?菌株中有三个连锁的基因位点：hsdR、 hsdM、 hsdS。 2）?hsdR编码限制性核酸内切酶---识别DNA分子特定位点，将双链DNA切断。 （DNA分子转化细胞：受体细胞去掉hsdR基因位点） 3）?hsdM编码产物是DNA甲基化酶---催化DNA分子特定位点的碱基甲基化反应。 4）? hsdS表达产物的功能是---协助限制性核酸内切酶和甲基化酶，识别特殊的作用位点。 三. 限制和修饰作用的分子机制 四. 限制性核酸内切酶的概念和命名 概念：一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。 命名： 1973年H. O. Smith和D. Nathams首次提出了命名原则，1980年Roberts在此基础上进行了系统分类： ★用具有某种限制性酶有机体的属名第一个字母(