转基因检测关键技术国内外研究应用概况.doc

转基因检测技术中国外研究概况 朱伟 农业昆虫和害虫防治 M091183 1.1转基因制品中外源基因检测策略 外源基因中目标基因是转基因制品开发中研究关键，在转基因检测中目标基因检测也是研究关键。用PCR技术检测转基因食品中外源基因，关键包含外源基因分离、提取、PCR扩增反应、PCR扩增产物检测和对所检测出阳性样品进行定量检测4个步骤。 1.2外源基因分离、提取 转基因食品种类不一样，分离提取外源基因具体方法不完全相同。通常来说，关键包含以下几步操作:①从食品样品释放出外源基因，包含将食品样研细，使细胞破碎，并用合适缓冲剂萃取破碎细胞中游离出来DNA:②去除萃取液中蛋自质;③将萃取液中DNA用酒精沉淀等。 1.3.PCR扩增反应 依据转基因食品中外源基因特点，设计并合成对应引物，控制适宜变性、退火及 延伸反应条件，以所分离外源基因DNA为模板在PCR仪中进行PCR扩增反应(Holst一Jensen，)。 1.4PCR扩增产物检测 采取合适方法对PCR扩增产物进行分析，假如PCR扩增反应产物和外源基因片段相同，表明该食品样品中含有外源基因，能够判定为转基因食品。相反，假如PCR扩增反应产物和外源基因片段不相同，则表明该食品样品中不含有这类外源基因，能够判定为非转基因食品。若使用巢式PCR则可免去该步骤(Tafreshi，)。 2.1对所检测出阳性样品进行定量检测 如测出阳性样品，则需对其进行定量检测(Hubner，1999;Fortin，:Hubner，)。另外，为了提升利用PCR技术判别转基因食品可靠性，在进行具体操作时应注意以下多个关键点:①依据所检测外源基因结构特点，设计对应引物。所设计引物必需和检测外源基因片段相匹配，既不能太短，也不要太长。在所检测食品样品中外源基因结构己知时，引物设计较为轻易。然而在大多数情况下，并不知道所检测食品样品中外源基因结构，所以引物设计和PCR扩增反应盲目性较大，为了确保检测结构可靠性，需要设计多个引物进行peR反应(Permingeat，)。②设置叮卜性对照检验试验方法可靠性。即用选定PCR方法对己知转基因食品进行检测。从理论上讲，用PCR方法对己知转基因食品进行扩增，最终应该取得阳性检测结果，假如检测结果为阴性，表明试验方法存在问题。一个可能是PCR扩增反应条件不适宜，或是样品中靶标基因数量不足。另外一个造成出现假阴性常见原因是样品中可能含有部分抑制PCR反应不明因子(Nicofas，)，所以必需经仔细分析，逐一排除上述原因影响，预防检测结果出现假阴性。③设置阴性对照检测样品及试验操作污染情况。从理论上讲，非转基因食品PCR反应结果应该展现阴性，假如非转基因食品PCR扩增反应呈阳性结果，则表明样品或试验环境存在污染。因为PCR反应灵敏度很高，所以必需严格遵守相关操作规则(Delan。，)，预防因污染而使检测结果出现假阳性。④预防非污染假阳性结果。在试验操作中，除了因试验污染产生假阳性外，有时还可能会因其它原因出现假阳性结果。比如，P35s序列是转基因植物常见开启子，因为植物本身不含有P35S序列，所以能够经过检测食品样品中是否含有P35s序列作为判别转基因食品依据(Hardegger，1999)。因为转基因操作中所使用P35S序列来自于花椰菜花叶病毒，所以假如植物在生长过程中被该病毒侵染，那么在采取上述方法判别转基因食品时，则会出现假阳性结果。为了预防出现这种情况，实际操作时，能够以转基因食品中外源基因多个特异性序列为模板，设计多对引物进行PCR反应(Germini，)。⑤对样品中外源基因因加工处理等原因遭到严重破坏转基因食品，采取常规PCR方法常常不能取得满意结果，能够采取巢式PCR技术进行检测(Kok，)。 2.2转基因制品DNA提取技术研究进展 现在，深加工制品转基因检测所需DNA提取技术在国外尚处于研究阶段，并没有形成系列化技术，商品化提取试剂盒种类单一。因为深加工制品种类繁多，生产工艺复杂，不一样制品采取不一样试剂盒，所以，缺乏针对不一样深加工转基因制品DNA提取技术。据了解中国农业科学院生物技术研究所现在正在进行大豆油、酱油、豆腐乳、淀粉和蜂蜜等DNA提取试剂盒研制，其DNA提取效率和正确率远远低于对初加工提取，试剂盒没有形成商品化。深加工转基因制品中DNA提取需突破两个关键技术:一是针对不一样深加__仁制品中含有多种抑制剂进行净化前处理技术，二是小片段、低含量DNA纯化和富集技术(Bcom，1999。;Mumy，)。欧盟等国家试验室针对不一样类型深加工产品，探索了OMA前处理技术，但形成商品化试剂盒极少。如Nec!eon助yt叩ure试剂盒关键适适用于提取含多糖较多加工品，NicolasGryson()应用多个试剂盒进行巧克力ONA提取，结果表明CTAB法和Nec!conRh