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罗氏 (Roche) 公司 Tunel 试剂盒操作说明书 (In situ cell death detection kit-POD 法) 一、 原理： TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling ）细胞凋亡检测试剂盒是用来 检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核 DNA 的断裂情况。其原理是荧光素 （fluorescein ）标记的 dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（ TdT Enzyme）的 作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂 DNA的 3 ’-OH末端，并与连接辣根过氧 化酶（ HRP，horse-radish peroxidase ）的荧光素抗体特异性结合，后者又与 HRP底物二氨基联苯胺（ DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异 准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于 正常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA断裂，因而没有 3 ‘-OH形成，很少能 够被染色。本试剂盒适用于组织样本 （石蜡包埋、冰冻和超薄切片） 和细胞样 本 （细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效 评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。 二、 器材与试剂 器材： 光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒 （塑料饭盒与纱布）、塑 料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等； 试剂： 试剂盒含： 1 号（蓝盖） Enzyme Solution 酶溶液： TdT 10 ×、 2 号（紫盖） Label Solution 标记液：荧光素标记的 dUTP 1×、 3 号（棕瓶） Converter-POD: 标记荧光素抗体的 HRP； 自备试剂： PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（ 100、95、90、80、70%）、 DAB工作液（临用前配制， 5 μl 20 ×DAB+1μL 30%H2O2+94μl PBS ）、 Proteinase K 工作液（ 10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl ，pH 7.4-8 ）或细 胞通透液（ 0.1% Triton X-100 溶于 0.1% 柠檬酸钠，临用前配制）、 苏木素或甲基绿、 DNase1 （3000 U/ml – 3 U/ml in 50 mMTris-HCl ，pH7.5 ， 10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA ）等。 三、 实验步骤 操作流程图：制作石蜡切片→脱蜡、水合→细胞通透→加 TUNEL反应液→加 converter-POD →与底物 DAB反应显色→光学显微镜计数并拍照。 具体操作步骤（石蜡包埋切片的检测）： 1. 用二甲苯浸洗 2 次，每次 5min； 2. 用梯度乙醇（ 100、95、90、80、70%）各浸洗 1 次，每次 3min； 注：上面两步是针对石蜡切片样本的处理 4. 用 Proteinase K 工作液处理组织 15-30 min 在 21 –37°C （温度、时间、 浓度均需摸索）如果凋亡细胞染色较弱时，可用高浓度的 Proteinase K （400 μg/mL）处理 5 分钟。其它替代方法： 石蜡切片的预处 理也可根椐实际情况可采用下述三种替代方法之一，即 蛋白酶 K 处理的步聚改用下述方法，其余步聚均相同： 替代方法 1: 将脱蜡及水合好的切片浸入通透液中 8-10 min （通透液： 0.1%TritonX-100 溶于 0.1%柠檬酸钠，需新鲜配制） 替代方法 2 ： 将脱蜡及水合好的切片浸入胃蛋白酶或胰蛋白酶中