CFX 荧光定量PCR仪操作指南(Biorad).pptxVIP

CFX96 实时荧光定量 PCR 仪操作流程及注意事项 开始运行仪器 打开电脑 打开定量 PCR 仪底座开关 启动 CFX Manager 软件 放置样品 将 PCR 反应体系加入到 0.2ml 低缘八联管，盖上管盖；或加入低缘 96 孔板，用光学级封膜封好。注 意，必须带一次性塑料手套，不要让手指接触到反应管表面。将反应管按顺序放入仪器的加热孔中。 设置程序，运行实验 定量 PCR 软件操作基本步骤为：a. 设置热循环程序文件（Protocol Tab） b.设置反应板文件 （Plate Tab）。 C.点击“Start Run”键，运行程序热循环程序文件（Protocol Tab）设置指南：点击 Edit（编辑）或 Create New（创建新程序）。 反应板设置文件（Plate Tab）设置指南：选择本次实验所要使用的荧光染料种类；单击样品类型； 如要某些反应孔第一荧光染料对应的样品类型为标准品（Standard），点击“Dilution Series”键可设置 其标准品浓度及稀释倍数。 点击“Start Run”键。单击 open lid（打开热盖）或 Close lid（关闭热盖）放置样品；单击 Start Run，保存文件，开始运行程序。 结果分析 PCR 反应结束后，软件会自动计算标准曲线和 Ct 值等。 如需进行表达量分析、等位基因分析等， 在软件窗口选择相应分析功能。 点击右上方的“Report”键，还可输出结果报告单 关闭运行仪器 实验结束后取出反应管，顺序关闭 CFX Manager 软件、定量 PCR 仪电源，关闭电脑。注意！CFX 仪器 上盖部分为全自动控制，在通电状态，严禁任何人为干涉上盖开启或关闭的行为，此类行为会导致上盖故 障，危及仪器使用。 ;CFX Manager 软件操作快速指南 实验操作程序设置图 1 显示实验设置窗口中一个预览的程序。 ;在图形或文本模式下选择任何需要编辑的一步（该步骤会用蓝色高亮显示），点击温度或保持时 间进行直接编辑。 点击 Insert Step 在程序中增加一个温度步骤。点击 Delete Step 在程序中删除选中的步骤。 3．点击 Add Plate Read to Step，在程序中指 定获取荧光数据的时间。如果当前的高亮显示步骤已经进行了读板设置，则这一选项变为 Remove Plate Read。如果在这一步不想获取数据，则点击 Remove Plate Read。 4．点击 GOTO ??骤的重复次数，改变程序中的循环次数，图 2 第 4 步。点击 GOTO 步骤数可改变 GOTO 循环中所包含的步骤。 增加一个梯度步骤： 在程序编辑控制窗口中，点击 Insert Gradient，图 2。 对梯度中最低和最高温度值进行编辑，在图形模式，文本模式下或出现在文本模式右侧的梯度范 围计算器中直接点击数值进行编辑，图 3。 ;;CFX Manager 软件数据分析快速指南 定量分析数据浏览 扩增图表可以显示实验中每个循环每个孔收集的相对荧光信号曲线。点击位于扩增图表下方的荧光 检查窗，选择需要显示的荧光数据，图 1。在孔选择器中点击孔，行或列来显示所选孔的荧光数据，图 1。 选中的孔是蓝色的，未选中的孔是亮灰色的。若把光标置于荧光信号曲线上，孔选择器中的孔上，数据电 子表格的孔上，或者标准曲线上均可以显示出相应的信息。 ;图表选项可用鼠标右键点击任何图表来复制或保存图像，或选择 Chart Options 来改变轴范围或删 除栅格，图 2。点击工具栏中 Trace Styles 按钮，或鼠标右键点击任何图表来设定制定孔的荧光信号曲 线颜色。鼠标左键点击任何图表，向下和拖动光标可以放大图表。孔的分群数据浏览使用工具栏中 Select Well Group 下拉菜单来浏览指定孔的分群数据，图 3。软件可以针对每个分群作为独立的实验来处理，每 一个分群可针对自己的设置进行分析，如进行自身标准曲线的分析。 ;;CFX Manager 软件基因表达分析快速指南 通过严谨的质量控制，您可以使用 Gene Expression Module of CFX Manager 软件来评估样品之间靶标 浓度的相对差异。这种应用最常用的使用是评估 cDNA 样品中靶标的浓度来推断其 mRNA 水平。通常，一个 或多个参照基因的含量被用来衡量目标基因的水平。参照基因用来校正上样的差异或各样品取样的差异。 通过生物学条件的研究，参照基因的表达水平通常不发生变化。 基因表达分析设置 图 1 显示各样品孔含单一的荧光，四个复制类群，包含两个不同靶标名称和两个不同的样品名称。 指定参照基因 ;