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目录 ;3;（一） 介绍 BD MatchmakerTM Library Construction Screening 试剂盒提供一种简便的方法构建 cDNA 文库用来进行酵母双杂交和单杂交的筛选，这些试剂盒结合了 BD Matchmaker TM Systems 和 BD SMART TM cDNA Synthesis 的技术，只需要用任何组织的 1 μg poly A+ RNA 或 total RNA 就能构建cDNA 文库。 通过一般细胞内克隆步骤，你能利用 BD Matchmaker Systems 所提供的灵敏的转录方法所构建的文库来进行单杂交或双杂交实验。 单杂交实验的原理——蛋白-DNA 相互作用实验 单杂交实验使你能够确定和描述蛋白与目的顺式 DNA 激活序列的绑定，该序列可能是处于 最小限度的启动子上游的用于增强转录的元件。这个实验也可以用于预测或新蛋白的 DNA 绑定结构域的确定。通过 BD Matchmaker One-Hybrid System 你可以很容易的获得这些基 因表达的蛋白 在 BD Matchmaker One-Hybrid 实验中，潜在的 DNA 绑定蛋白基因是与克隆在 pGADT7-Rec2 （为单杂交设计的低拷贝载体）上 GAL4 激活结构域（AD）序列一起融合表达的。一个或多 个目的 DNA 序列的串联拷贝被构建在 pHIS2（含有 HIS3 营养缺陷报告基因的报告载体）。 DNA 绑定蛋白和目标序列的相互作用会激活 HIS3 的转录（Figure 1），该过程要在宿主菌 株 Y187（组氨酸缺陷型）中进行并在缺少组氨酸的培养基生长 双杂交实验的原理——蛋白-蛋白相互作用的原理 双杂实验分析能用于鉴定新的蛋白与蛋白相互作用、确定疑似作用、明确结构域。在一个 BD Matchmaker 双杂交实验分析中，诱饵基因是与 GAL4 DNA（DNA-BD）绑定结构域序 列融合表达的，同时其他的基因或其 cDNA 与 GAL4 激活域（AD）序列融合表达（Fields Song, 1989; Chien et al., 1991）。当诱饵与文库融合蛋白在 AH109（ADE2, HIS3, lacZ, MEL1）这样的报告菌株中相互作用， DNA-BD 和 AD 相接近结合，并激活报告基因转录 （Figure 2) DNA-BD 和 AD 的融合序列是将 cDNA 序列克隆进酵母表达载体 pGBKT7 和 pGADT7-Rec 载体中来实现的。pGBKT7 表达了与 GAL4 DNA-BD 融合的蛋白，而 pGADT7-Rec 表达与 GAL4 AD 相融合的蛋白。在酵母中，两种融合基因在组成型启动子 PADH1 下高水平表达的。其他的像 pGBT9、ADH1、pAS2-1、pBridge 基于 GAL4 的克隆载 体与这个试剂盒也相兼容的??pBridge 载体能被用于鉴定三蛋白复合体的酵母三杂交实验。;双杂和单杂文库的建立和筛选 双杂和单杂文库的建立和筛选由四个主要步骤组成，（注：有两个步骤遵从同样的流程）。 如果想去筛选双杂交相互作用，第一步是建立一种 DNA-BD 融合载体。第二步是使用试剂 盒所提供 BD SMART 试剂从你所抽提 poly A 和 total RNA 建立cDNA 文库。 就酵母双杂筛选而言，如果你打算我们从预制的 BD Matchmaker cDNA 文库选取来替代自 己准备文库，可以跳过 RNA 分离、cDNA 合成、AD 融合文库构建。这些包含非常广泛组 织的文库被有效的保存在甘油中或预转化到 Y187 酵母菌株。我们也提供一种 BD Matchmaker 文库服务，基于这个服务，提供给我们你想筛选的组织与细胞，我们为你制作 AD 融合文库。请注意，我们尽管在高拷贝酵母表达载体中建立了很多的预制和预转化的 BD Matchmaker cDNA 文库，对双杂工作非常理想的，但他们很少适合单杂分析。在单杂分 析中我们推荐使用 pGADT7-Rec2 and pHIS2 等低拷贝载体，因为他们产生较少的假阳性克 隆。 其次是cDNA 合成，把 cDNA 克隆到 BD Matchmaker AD 克隆载体中建立一个 GAL4 AD 融合文库，如果是建立双杂文库是 pGADT7-Rec 载体，单杂则是pGADT7-Rec2 载体。克隆 在细胞内通过同源重组来进行的，这一步利用酵母替内高效重组系统使 ds cDNA 和相应的 GAL4 AD 质粒融合。采用重组介导的克隆，文库的构建和筛选能紧密的完成，而不需要任 何的细菌转化和扩增步骤。简单的把cDNA 文库和相应的 BD Matchmaker 载体转化到酵母 中，然后把细胞用于成分缺省培养基筛选双