Prescission蛋白酶制作及使用方法..docVIP

v1.0 可编辑可修改 Prescission 蛋白酶制作及使用方法 柱下酶切用酶的制作方法 1L TB 菌体用 PBS重悬至 35ml 做高压裂解， 最终 40ml 总量。上清用流速， 挂 3-4ml 柱子，PBS漂洗 30ml。 用含有 10%甘油的洗脱液洗脱，每管收集体积为 2ml，只取主峰，可以粗略定量，也可以取百分之一的 量在 Akta 上用上样泵来做积分定量 （参考下面的积分定量方法举例） 。也可以用分光光度计定量， 一般 可用稀释 20 倍定量。马上分装成每管，可切 5ml 介质。 柱上酶切用酶的制作方法 亲和纯化方法同柱下酶切， 洗脱液不含甘油， 得到 10ml 左右洗脱液， 浓缩 10 倍，再加入 10ml 含有 10% 甘油和 2mMDTT的 PBS稀释，一共浓缩三次换 buffer ，每次浓缩时间一般在 30 分钟以内。最终浓缩至 10mg/ml，浓缩 10 分钟混匀一次。尽快分装成每管，可切 5ml 介质。 柱上酶切用酶的 Q纯化制作方法 亲和纯化方法同柱下酶切，洗脱液不含甘油，收集后加水大于三分之一。过 Q柱， AB 液配方中含有 10% 甘油， 8%B洗脱， 50%B直接洗下后积分定量，分装。 粗略定量参考 2000 峰宽为，蛋白质总量为 24mg，取了 12ml，浓度为 2mg/ml，直接分装的话，可以用 125ul 和 250ul 每份。 积分定量方法举例 取 10ul ppase 浓缩液，用本底缓冲液 （ PBS）稀释到 500ul ，用上样泵做积分定量， 积分体积为 325mAu*ml， 可知浓缩好的蛋白质光吸收为每毫升为，光吸收为 1，浓缩好的蛋白质浓度为 ml，一共 24mg蛋白。 表达 1. 取 -80 度保存的质粒 pGEX-PPase转化 BL21（ DE3）感受态，涂布， 37 度孵箱培养 12~16 h 。 挑取单克隆到 50ml LBA 培养基 37 度培养 12-15 小时。 1%接种到 1L TBA中，培养 3 小时， 4 度水浴降温， 加终浓度为 0.2mM的 IPTG，度诱导培养 18 小时。 4. 4000rpm 离心 20 分钟收菌。加入 PBSE（ 1mM EDTA）至终体积 30-40ml 重悬。 纯化 1． 高压裂解 2-3 次。 2． 万转离心 30 分钟，留上清。 1 v1.0 可编辑可修改 3． PBSS平衡 5ml 的 GST柱，上样，PBSS漂洗，4℃放置过夜， 等 RNA降解，再用含有 10%甘油和 %Tween20 的酶切 buffer 漂洗干净。洗脱用含 10%甘油的还原性谷胱甘肽溶液， 2ml 每管收集，取峰尖 3* 。 4． 上样泵灌盐酸胍再生柱子，重力流灌水，灌 20%乙醇， 4℃保存柱子。 酶切效率确定 5ul ，10ul ， 20ul 酶切 PH35C蛋白 3-4 天，电泳检测酶切产物，全部切开了。估计 10ul 过夜酶切 1L 的 培养产物足够，下次实验再做验证。 保存 用 PCR管，分装 50ul 每管，冻存于 -80 度。 使用 谷胱甘肽洗脱的融合蛋白，加入 1 份 PPase，混匀后 4 度过夜酶切。 缓冲液 1． 10*PBSS（欧蒙基础） 配方： 5 包 PBS粉剂（欧蒙），加入 360ml 5M NaCl ，定容到 500ml， 4℃保存。 2． 500ml 2M Tris （），500ml 2M Tris （） 350ml 水溶解 121.1g Tris 碱，加转子搅拌或振荡下溶解（需要 10 分钟左右），加浓盐酸调 pH至所 需值，抽滤后 4℃保存。 如温度升高，可加入预冷的水降温，温度下降 1 度 pH 升高。约需盐酸 160 ml ，约需盐酸 70 ml ， 约需 60ml，约需 42ml，约需 40ml。 Tris 缓冲液稀释 10 倍 pH 下降，故如稀释为 20mM使用，则 pH 下降。 3． 1L 2M Tris 不调 pH 800ml 水溶解 242.2g Tris 碱，加转子搅拌，定容至 1L，抽滤后 4℃保存。 4． 500ml 0.5 mM EDTA 将 93.05g 二水乙二胺四乙酸二钠加入 400ml 水中，加入氢氧化钠颗粒调节 pH（约需 10g 氢氧化钠 颗粒），先加入 7g 左右，用搅拌棒彻底搅匀，在转子搅拌下，使其大部分溶解，静置一会儿，使气 泡排出，并观察沉淀量。再继续搅拌，少量加入氢氧化钠颗粒，观察 pH 变化，勿使其变化过快， 完全溶解后，加入 4℃预冷的水（此时 pH 升高），继续调节 pH 为，最终定容至 1L，抽滤除去杂质， 避光保存于 4℃。 5． 10% Tween 20 2 v1.0 可编辑可修改 2