transwell实验原理与步骤 (2).pptxVIP

;;3;四唑盐是一种能接受氢原子的染料，简称 MTT。活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使 外源性的MTT 还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基 亚砜能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在 490nm 波长处测定其光吸收值，可 间接反映细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT 结晶物形成的量与细胞数成正比。 MTT 溶液：称取 250mgMTT，放入小烧杯中，加 50ml 培养液或平衡盐溶液在电磁力 搅拌机上搅拌 30min，5mg/ml。用 0.22um 的微孔滤器除菌，分装，4℃保存备用，两周内 有效。 操作步骤 接种细胞：用 0.08%胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含 10%胎牛血清的 DMEM 培 养液配成单个细胞悬液，以每孔 103～104 个细胞接种于 96 孔培养板中，每孔体积 200ul。 培养细胞：将培养板移入CO2 孵箱中，在 37℃、5% CO2 及饱和湿度条件下培养。 （培养时间取决于实验目的和要求） 呈???：每孔加入 MTT 溶液（5mg/ml）20ul，37℃孵箱中继续孵育 4h，终止培养， 小心吸弃孔内培养上清液(对于悬浮生长的细胞，需离心 1000rpm，5min)。每孔加入 150ul DMSO，振荡 10min，使结晶物充分溶解。 比色：选择 490nm 波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。以时 间为横轴，光吸收值为终轴绘制细胞生长曲线。 （五）、注意事项 选择适当的细胞接种浓度。在进行MTT 试验前，对每一种细胞都应测其贴壁率、 倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，然后确定试验中每孔的接种细胞数和培养 时间。 避免血清干扰，一般选小于 10%胎牛血清的培养液进行试验。 设空白对照，与试验平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔。最后比色时，以 空白孔调零 【原理】活细胞的线粒体中存在 NADPH 相关的脱氢酶类，可将黄色的MTT 还原为水 不溶性的蓝紫色甲臜，死亡的细胞该酶活性丧失，MTT 不被还原，用 DMSO 溶解甲臜后用 酶标仪于 490nm 波长处检测光密度值。 【方法】按不同肿瘤细胞的生长速率，将一定数量的处于对数生长期的细胞 90μl/孔接 种于 96 孔微量培养板内，培养 24 小时后加入药液 10μl/孔（当然要根据你的实验设计不同 的药物浓度），每个浓度均为 3 个复孔，另设无细胞调零孔。置于 37℃，5%CO2 培养箱 培养一定时间后（时间就要看你的实验设计多长时间，几个时间点了）加入 MTT 液 20μl/ 孔（MTT 用 PBS 配制成 5mg/ml),继续培养 4 小时，吸出上清液，加入 150μlDMSO 使甲臜 溶解，摇匀，然后用酶标仪测 OD570 值。 【注意事项】悬浮细胞必须离心后才能吸出上清再加入 DMSO.