ELISA的原理和类型.pptx

ELISA 的原理 ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的 抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活 性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。 用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记 的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量 呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检 物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间 接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。 ELISA 的类型 ELISA 可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1） 固相的抗原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为“酶 联物”、“结合物”（conjugate）；（3）酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测 的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。用于临床检验的 ELISA 主要有以下几种 类型： 双抗体夹心法测抗原;为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。 因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP 和尿 液 hCG 等）时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱 钩状效应。 假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如 HBsAg 的a 决定簇，也可 用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在 HBsAg 的检测中应注意亚型 问题，HBsAg 有adr、adw、ayr、ayw4 个亚型，显然每种亚型均有相同的 a 决定簇的反应 性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。 双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。RF 是一种自身抗体， 多为 IgM 型，能和多种动物 IgG 的 Fc 段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有 RF，它可充当抗原成份，同时与???相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。采用 F（ab’） 或 Fab 片段作酶结合物的试剂，由于去除了 Fc 段，从而可消除RF 的干扰。双抗体夹心法 ELISA 试剂是否受RF 的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标（参见 6.2）。 双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分 子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。 双抗原夹心法测抗体 反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的 抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释， 可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗 HBs 的检测常采用本法。 本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。 间接法测抗体(我公司分装 TORCH 及传染病试剂盒大多采用本法); 本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被 抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。 间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结 果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生 反应的杂质，例如以 E.Coli 为工程酶的重组抗原，如其中含有 E.Coli 成份，很可能与受过 E.Coli 感染者血清中的抗 E.Coli 抗体发生反应。抗原中也不能含有与酶标抗人 Ig 反应的物 质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的 Ig 去除，试验中也发生假阳性反应。 另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果。 间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体。病人血清中受检 的特异性 IgG 只占总 IgG 中的一小部分。IgG 的吸附性很强，非特异 IgG 可直接吸附到固 相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白 质（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间隙。另外，在检测 过程中标本须先行稀释（1:40~1:200），以避免过高的阴性本底影响结果的判断。 1.2.4 竞争法测抗体;;原理