主要拱顶蛋白在猪繁殖与呼吸综合征病毒感染中的调控作用.pdfVIP

摘 要 摘 要 猪繁殖与呼吸综合征 （Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS ）对养猪 业危害巨大，该病的病原是猪繁殖与呼吸综合征病毒 （Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV ）。PRRSV 基因具有高突变性和多样性，是最易突变 的RNA 病毒之一，这使得现有的商品化疫苗免疫效果很不理想。研究发现，PRRSV 在 体内外均有巨噬细胞亲嗜性，尤其在肺泡巨噬细胞（PAM ）中病毒含量很高。该病毒在 临床上常常表现为持续性感染和与其他疾病混合感染等特点，从而造成该疾病在规模 化养殖场中难以防控，严重制约了养猪业的经济效益。为了更好的防控该病，不同科研 工作者从多个角度致力于 PRRSV 致病机制的研究并取得了长足的进展。目前为止， PRRSV 的致病机制尚不完全清楚，这也是目前PRRS 无法有效防控的重要原因之一。 主要拱顶蛋白（Major vault protein, MVP ）是真核细胞中最大的核糖核蛋白穹窿体 的主要组成部分，在巨噬细胞和树突状细胞中含量很高。据报道，MVP 可能是一种新 型的病毒诱导的宿主因子，在病毒感染方面发挥一定作用。研究发现，MVP 的功能与 耐药性、核质运输、细胞信号通路、免疫等有关。近几年，有研究发现，MVP 在病毒 感染方面也发挥一定作用。并且，有研究表明，MVP 可以抑制HCV 和HBV 的复制及 其蛋白质合成，过表达MVP 能够抑制VSV 、IAV 和EV71 的复制及合成。目前还没有 关于MVP 在PRRSV 感染中作用的研究报道。我们前期研究发现，在PRRSV 感染的 PAMs 中，MVP 表达下调。为进一步研究MVP 在PRRSV 感染中的作用，本研究采用 PRRSV 易感细胞CRL2843CD163 细胞系和原代PAM ，通过过表达和敲低MVP 研究其对 PRRSV 感染的调控作用，得到如下结果： 1. 利用构建的MVP 重组腺病毒感染CRL2843CD163 细胞，通过qPCR、Western blot 和TCID50 分析在CRL2843CD163 细胞中过表达MVP 对PRRSV 复制的影响。试验结果 显示，过表达MVP 显著抑制PRRSV 在CRL2843CD163 细胞中的复制。 2. 设计合成MVP 特异性siRNA，转染CRL2843CD163 细胞，敲低细胞内源性MVP 表达，探究对PRRSV 复制的影响。试验结果显示，敲低MVP 表达显著促进PRRSV 在 CRL2843CD163 细胞中的复制。 3. 为了验证MVP 抑制PRRSV 感染的作用，CRL2843CD163 细胞先转染MVP 特异 性siRNA，再转染MVP 重组腺病毒质粒，然后感染PRRSV ，分析MVP 对PRRSV 复 制的作用。试验结果显示，敲低MVP 表达能够部分逆转过表达MVP 对PRRSV 感染 CRL2843CD163 细胞的抑制作用。 4. 原代PAM 转染MVP 特异性siRNA，分析敲低MVP 表达对PRRSV 复制的影 响。试验结果显示，敲低MVP 后能够显著促进PRRSV 在原代PAM 中的复制。 I 西北农林科技大学硕士学位论文 5. 在CRL2843CD163 细胞中过表达MVP ，PRRSV 感染后，qPCR 检测抗病毒细胞 因子mRNA 的表达水平。试验结果显示，在PRRSV 感染后的CRL2843CD163 中过表达 MVP 诱导了IFN-α 和ISG15 mRNA 表达水平的显著升高。在原代PAM 中敲低MVP 表达，PRRSV 感染后，通过检测细胞上清对 NDV-GFP 在 CRL2843 细胞中复制的影 响，间接测定细胞上清中的干扰素水平。试验结果显示，敲低MVP 表达并被PRRSV 感染后的PAM 细胞上清促进了NDV-GFP 在CRL2843 细胞中的复制。 综上所述，过表达MVP 显著抑制PRRSV 在CRL2843CD163 细胞中复制，敲低MVP 显著促进PRRSV 在CRL2843CD163 细胞和PAM 中的复制，说明MVP 能够发挥