苹果砧木不定根发生相关基因的鉴定和可变剪切分析.pdfVIP

摘 要 摘 要 不定根诱导是苹果砧木无性繁殖的关键环节，内部因素和外部环境的变化均对不 定根诱导有重要的调控作用。目前，有关不定根发育的研究多集中于基因的转录水平， 其它层次的研究较为薄弱。本研究以苹果矮化砧木‘T337’为材料，利用iTRAQ （Isobaric tag for a relative and absolute quantitation ） 和 SMRT （Single molecule real time sequencing ） 测序技术，探究不定根发生过程中的蛋白水平变化和复杂的可变剪切现 象，对于丰富不定根发生的分子机制具有重要意义。主要结果如下： 1. 建立了‘T337’组培苗不定根发生诱导期的蛋白质组学数据库，分析了外源吲哚 -3-丁酸（IBA ）处理后‘T337’的形态和激素水平的差异，明确了参与不定根产生的差异 蛋白和信号通路。（1）外源（IBA ）处理诱导了‘T337’组培苗不定根的产生，生根率和 根长显著增加，生长素（IAA ），脱落酸（ABA ）和油菜素内酯（BR ）的含量前期增加， 后期降低，赤霉素（GA ），玉米素（ZR ）和茉莉酸甲酯（JA ）则相反。（2 ）利用iTRAQ 蛋白组学技术，在不定根发生的诱导期（第 3 d ）共鉴定得到 3,355 个差异表达蛋白 （DEPs ），进一步的分析表明，这些蛋白主要集中在激素的代谢和信号转导、碳水化合 物代谢和能量供应、泛素化-蛋白酶体系统参与的蛋白质体内平衡、活性氧和一氧化氮 信号转导、细胞壁重塑等生物学过程。（3 ）利用RT-qPCR 验证了9 个参与植物激素信 号转导的差异蛋白在mRNA 水平上的差异。最终构建了外源IBA 诱导的‘T337’苹果砧 木不定根发生的潜在分子调控网络。 2. 建立了‘T337’组培苗不定根发生过程中的全长转录组数据库，更新了参考基因 组‘金冠’的基因结构注释，鉴定了不定根发生过程中发生的可变剪切事件，并对可变剪 切事件进行定量和差异表达分析。（1）利用SMRT 测序技术鉴定到覆盖23,672 个基因 的71,637 条转录本异构体，其中12,234 条转录本异构体是已知转录本，52,334 条转录 本异构体属于已知基因的新转录本，剩余7,069 条转录本异构体属于新基因的转录本， 共鉴定出 5,358 个新基因。（2 ）约20% 的差异表达基因在更新参考注释后未呈现差异 表达，新的差异表达基因随之被鉴定出来，说明 SMRT 测序数据可以提高参考基因组 注释。（3 ）在8,026 个基因中鉴定出27,005 个可变剪切事件，包括外显子跳跃（SE）， 内含子保留 （RI ），可变5‘端剪切（A5 ），可变3’端剪切（A3 ），转录起始区域可变剪 切（AF ），转录终止区域可变剪切（AL ）以及外显子互斥（MX ）共7 种类型，其中内 含子保留事件所占比例最高（48.87 % ）。GO 富集的结果显示根的形态发生、根分生组 织的生长、根细胞分化等多条通路以及生长素的运输和信号转导通路等作为潜在的参 与不定根的通路被显著富集，KEGG 富集分析表明碳代谢，氨基酸的合成，RNA 运输， RNA 降解等通路基因显著富集。（4 ）在不定根发生诱导期、起始期和伸长期分别鉴定 I 西北农林科技大学硕士学位论文 到482 、435 和338 个差异可变剪切事件，涉及到384、354 和271 个基因。GO 富集的 结果显示，生长素激活的信号转导通路，根生长发育，侧根形成，分生组织起始以及 茎轴系统形态发生的通路显著富集。（5 ）根据GO 富集的结果筛选出26 个与不定根发 生相关的差异剪切基因，包含了34 个差异剪切事件，这些转录本异构体确切的基因功 能值得更进一步的研究。 关键字：苹果砧木；不定根发生；蛋白质组；单分子实时测序；全长转录组；可变剪切 II 目 录 目 录 摘