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12 生物工程（2）班合 肥 学 院HEFEI UNIVERSITY 题 目: PCR 技术论文 系 别: 生物与环境工程系 专 业:_ 12 生物工程 2 班 学 号 : 1202012043 姓 名: 乐一鹏 指导教师: 阚劲松 时间： 2014 年 11 月 27 日 12 生物工程（2）班PCR 技术论文 摘要：PCR 技术又称无细胞分子克隆系统或特异性 DNA 序列体外引物定向酶促扩增法， 是体外酶促合成特异 DNA 片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步 反应组成一个周期,循环进行,使目的 DNA 得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、 操作简便、省时等特点， 是基因扩增技术的一次重大革新。PCR 技术可将极微量的靶 DNA 特异地扩增上百万倍，从而大大提高对 DNA 分子的分析和检测能力，能检测单分子 DNA 或对 每 10 万个细胞中仅含 1 个靶 DNA 分子的样品，因而此方法立即在分子生物学、微生物学、 医学及遗传学等多领域广泛应用和迅速发展。 关键词：PCR 原理、PCR 过程及应用、关于 PCR 技术要点 1、PCR 技术的基本原理 DNA 的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链 DNA 在多种酶的作用下可 以变性解链成单链，在 DNA 聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现， DNA 在高温时也可以发生变性解链，当温度降低 后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制 DNA 的变性和复性，并设计引物做 启动子，加入 DNA 聚合酶、dNTP 就可以完成特定基因的体外复制。 PCR 的过程类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡 核苷酸引物。PCR 由变性--退火(复性）--延伸三个基本反应步骤构成：①模板 DNA的变性：模板 DNA 经加热至 93℃左右维持一定时间，使含有所需扩增分析序列的靶 DNA 双链经热变性处理解开为两个寡聚核苷酸单链，然后加入一对根据已知 DNA 序列 由人工合成的与所扩增的 DNA 两端邻近序列互补的寡聚核苷酸片段作为引物，即左右 引物。此引物范围就在包括所欲扩增的 DNA 片段，一般需 20-30 个碱基对，过少则难 保持与 DNA 单链的结合；②模板 DNA 与引物的退火(复性)：模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至 55℃左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的延伸： DNA 模板--引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下，于 72℃左右，以 4 种三磷酸脱氧 核苷（ dNTP） 为反应原料，靶序列为模板， 按碱基配对与半保留复制原理，按 5到 3方向将引物延伸、自动合成新的 DNA 链、使 DNA 重新复制成双链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”， 每次循环延伸的模板又增 加 1 倍，亦即扩增 DNA 产物增加 1 倍，经反复循环，使靶 DNA 片段指数性扩增。每完 成一个循环需 2～4 分钟， 2～3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 2、PCR 技术的反应体系与反应条件 （一）标准的 PCR 反应体系： 10×扩增缓冲液 10ul 4 种 dNTP 混 合 物 各 200umol/L 引 物 各 10～100pmol 模 板 DNA 0.1～2ug Taq DNA 聚 合 酶 2.5u 12 生物工程（2）班 Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul （二）PCR 反应五要素： 参加 PCR 反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物： 引物是 PCR 特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板 DNA 序列，就能按其设计互补的寡核苷酸 链做引物，利用 PCR 就可将模板 DNA 在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则： ①引物长度： 15-30bp，常用为 20bp 左右。 ②引物扩增跨度： 以 200-500bp 为宜，特定条件下可扩增长至 10kb 的片段。 ③引物碱基：G+C 含量以 40-60%为宜，G+C 太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异 条带。ATGC 最好随机分布，避免 5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是 3’端的互补，否