基因的体外重组及转化.pptVIP

7 基因的体外重组与转化;重组过程中，需要考虑的因素： （1）连接效率高、易于筛选； （2）便于回收外源基因； （3）在载体的启动子控制之下，并置于正确的阅读框之中，以便表达。;1 DNA片段的体外连接;DNA连接酶 ：由大肠杆菌基因组DNA编码，以NAD+作为能源辅助因子。；只能连接粘性末端 T4 DNA连接酶： 由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码，以ATP作为能源辅助因子。 1970年：容易制备，而且可以连接平末端DNA分子及单链DNA(RNA)分子，所以在基因克隆中应用广泛。;ＤＮＡ连接酶;;一、粘性末端的连接;1. 两段DNA的连接;2. DNA片断与载体的连接;;二、平末端（blunt end）的连接;1972年，斯坦福大学的P. Labban和P. Kaiser提出。;;用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。; ; ;④缺点：;（3）DNA接头 (adapter)连接法;;;;碱性磷酸酶处理质粒载体;载体自连及去磷酸化示意图;常用碱性磷酸酶;;;;连接体系;1. 载体和插入片段的摩尔浓度比载体：插入片段的摩尔数的变化范围可为8：1到1：16，但通常的变化范围是3：1到1：3。在最小的反应体积中，通常一个连接反应用10-50ng的载体DNA。 2. 平末端连接在22℃保温4-16小时，粘性末端在22℃保温3小时，或16℃保温16小时。大多数连接反应用T4DNA连接酶，但大肠杆菌的DNA连接酶可用于粘性末端的连接，平末端连接时用此酶，活力较低。 3. 载体和插入片段的纯度应较高，溶解的溶剂最好使用灭菌的双蒸水而不是TE，毕竟TE中含有离子，可能影响连接反应。;三、PCR产物的连接;引物1;GCTAGCCGG ;带酶切位点的PCR产物;2. 与T载体直接连接;;四、DNA体外连接应注意的事项;EcoRI;2. DNA插入的方向正确;3. 插入基因的开放阅读框（ORF）正确;4. 防止载体自身环化连接;;1. 载体自身环化连接;;;;2 重组体导入细菌细胞;重组体的转化;;黑膜试验;;1. 目的; 原核细胞的转化（细菌转化）;使用丧失了限制体系的大肠杆菌。如K12系列的大肠杆菌。;;用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。;;CaCl2处理;4. 制备过程;CaCl2法制备感受态细胞流程;转化-热激发;转化示意图;1. 0℃的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的??分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态； 2. 加入DNA，Ca2+又与DNA结合形成羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上； 3. 经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。;二、重组DNA导入大肠杆菌;每?gDNA转化成功的细菌克隆数。 ;10ng载体DNA;电击法 (Gene transfer by electroporation) ;LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6;4. 平板培养基培养细菌;用氯化钙化学转化;环形重组质粒 质粒自我连接:干扰因素;①生长状态;把重组的噬菌体?DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染能力的?噬菌体颗粒。;;cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在32℃下培养细菌时能够保持溶源性。 但当温度升高到44℃—45℃时，就会导致cI基因编码的阻遏蛋白失活，?DNA复制、外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。;;;(5) 体外包装过程 ;体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每?g ?DNA能形成106噬菌斑）。 ;4 重组克隆载体导入真核细胞;转化率高的菌株； 有突变的菌株（与导入的载体基因互补）； 不育的菌株（不会与其他酵母接合）。;（1）利用原生质球进行转化 ;; 酵母;叶盘;植物细胞;又称高速微型子弹射击法（High-velocity microprojectiles);基因枪法(Biolistic-bombardment);4. 农杆菌（agrobacterium）介导;;（1）原理：;（2）特点：;脂质体有商业试剂盒（如Life Technologies）。;直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。;二乙氨乙基（diethyl-aminoehtyl，DEAE）葡萄糖能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。;;外源基因导入细胞的方法;感谢您的关注