基因表达及基因重组.pptVIP

cDNA文库 以 mRNA 为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链 cDNA，与适当载体连接后转入受体菌，即获得cDNA文库。 DNA mRNA mRNA 反转录酶 cDNA mRNA的提取与纯化 从mRNA制备cDNA 逆转录酶 ＤＮＡ聚合酶 mRNA cDNA 杂化双链 cDNA文库法 cDNA 基因重组 转化 核酸探针 cDNA文库 聚合酶链式反应（PCR） 目的基因 基因载体 重组体 （二）克隆载体的选择和构建 （三）外源基因与载体的连接 1. 粘性末端连接 方式：(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接 配伍末端连接 非配伍末端连接 Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶 15oC GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ切割 载体DNA用Bam HⅠ切割 重组体 载体自连 目的基因自连 同一限制酶切位点连接 不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接 Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点 + EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。 2. 平端连接 适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端 目的基因 载体 限制性内切酶 限制性内切酶 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 载体自连 目的基因 自连 3. 同聚物加尾连接 在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。 5′ 3′ 3′ 5′ 载体DNA 5′ 3′ 3′ 5′ 目的基因 限制酶或机械剪切 限制酶 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ T(T)nT T(T)nT 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ A(A)nA A(A)nA 3′ 5′ λ-核酸外切酶 λ-核酸外切酶 末端转移酶 + dATP 末端转移酶 + dTTP T(T)nT A(A)nA A(A)nA T(T)nT T4 DNA连接酶 15oC 重组体 4. 人工接头(linker)连接 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 人工接头及其应用 CCGAATTCG GGCTTAAGC 5′- 3′- Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ 受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent) 导入方式 转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection) （四）重组DNA导入受体菌 （五）重组体的筛选 1. 直接选择法 (1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹 2. 免疫学方法 如免疫化学方法及酶免检测分析等 (插入失活法) 抗药性标记选择 α互补 α 互补的检测 原位杂交 Southern印迹 鸡的β肌球蛋白的克隆和检出 重组DNA技术操作过程可形象归纳为 小 结 分 分离目的基因 切 限制酶切目的基因与载体 接 拼接重组体 转 转入受体菌 筛 筛选重组体 （二）工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 重组DNA技术中常用的工具酶 工 具 酶 功 能 限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA DNA连接酶 催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 DNA聚合酶Ⅰ 合成双链cDNA分子或片段连接 缺口平移制作高比活探针 DNA序列分析 填补3′末端 Klenow片段 又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5??3?聚合、3??5?外切活性，而无5??3?外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA 3?末端标记等 反转录酶 合成cDNA 替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析 多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5′羟基末端磷酸化，或标记探针 末端转移酶 在3′羟基末端进行同质多聚物加尾 碱性磷酸酶 切除末端磷酸基 限制性核酸内切酶 定义 限制性核酸