T CVMA 41-2020 犬致病性钩端螺旋体荧光PCR检测方法.pdf

ICS 11.220 B 41 团 体 标 准 T/CVMA 41-2020 犬致病性钩端螺旋体荧光PCR 检测方法 Real-time PCR method for detection of canine pathogenic leptospira 2020-12-22 发布 2020-12-22 实施 中 国 兽 医 协 会 发 布 T/CVMA 41-2020 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020 《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国兽医协会提出并归口。 本文件起草单位：上海市动物疫病预防控制中心。 本文件主要起草人：王晓旭、王建、徐锋、赵洪进、沈莉萍、齐新永、宁昆、鞠厚斌、杨德全、杨 显超、龚国华、夏炉明、朱九超、葛杰、白艺兰。 1 T/CVMA 41-2020 犬致病性钩端螺旋体荧光PCR 检测方法 1 范围 本文件规定了犬致病性钩端螺旋体荧光PCR检测的操作方法。 本文件适用于犬的血液、尿液、肾脏组织等样本或分离菌株中犬致病性钩端螺旋体核酸的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 14926.46 实验动物 钩端螺旋体检测方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BHQ ： 无荧光淬灭基团（black hole quencher ） Ct值： 每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环数（cycle threshold ） DEPC ：焦炭酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate ） DNA ： 脱氧核糖核酸 （deoxyribonucleic acid ） ddH O ： 双蒸水（double-distilled H O ） 2 2 FAM ： 6-羧基荧光素 （6-carboxy-fluorescein ） PCR ： 聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction ） PBS ： 磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline buffer ） 5 试剂与材料 5.1 引物和探针 本文件参照犬致病性钩端螺旋体特有的LipL32 基因序列，设计引物序列如下： 上游引物： 5 ＇- RCCAGGCGAYGGAGACT-3 ＇ 下游引物： 5 ＇- GGTTTTGCTTTCGCAGCTTT-3 ＇ 探针序列： 5 ＇-FAM- ATGCCACATTGGTTTGA-BHQ-3 ＇ R ：A/G ，Y ：C/T 5.2 试剂 5.2.1 DNA 提取试剂：核酸提取液配制详见附录A ，也可选取商品化DNA 提取试剂盒。 2