大学课程遗传学实验实验八电泳鉴定与图谱构建JC课件.ppt

实验八 琼脂糖凝胶电泳 鉴定与图谱构建 实验目的和要求 1. 学习和掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理，它 是 分离鉴定 和 纯化 DNA 片段 的标准方法。 2. 掌握使用水平式电泳仪的操作方法 。 实验原理 在 pH 值为 8.0 ～ 8.3 时，核酸分子 碱基几乎不解离，磷酸全部解离， 核酸分子带负电，在电泳时向正极 移动。 DNA 分子在琼脂糖中泳动时有 电荷 效应和分子筛效应 ，但主要为分子 筛效应 。 ? 适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作 用下，使 分子大小 和 构象不同 的核酸分子泳动率出现 较大的差异，从而达到分离核酸片段的目的。 ? 核酸分子中嵌入荧光染料（如溴化乙啶 Ethidium bromide, EB ）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所 在的位置。 Sybergreen 不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围 琼脂糖浓度 （％， W/ V ) DNA 分子的有效分离范围（ kb) 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 2.0 0.1-2 实验器材 电泳仪 微波炉 电泳槽与制胶模具 紫外透射仪 凝胶成像分析系统 样品和试剂 ? DNA 分子量标准品， DNA 样品 ? 琼脂糖 ? 1 ×电泳缓冲液（ TBE ） ? 6 ×上样缓冲液 ? 荧光染料 Sybergreen 操作方法与步骤 操作步骤 1. 准备 用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上， 并架好梳子 2. 配制 1% 琼脂糖凝胶及倒胶 具体步骤： ? 三角瓶内： 1g 琼脂糖 +100ml(1 × TBE) ? 煮胶溶解 ? 冷却至 60 ℃ ( 不烫手 ) ? 加 荧光染料 ? 倒板 ? 室温下充分凝固 ? 垂直向上拔出梳子 ? 将胶板放入电泳槽 ? 向电泳槽中加入 1xTBE 缓冲 液至刚没过凝胶表面。 水平式电泳装置 6X 上样缓冲液组分： 300 mM NaOH ， 6 mM EDTA ， 0.25% 溴酚蓝， 0.25% 二甲苯酚， 2.5% 聚蔗糖 作用（ 1 ） 指示显示电泳的进程。 （ 2 ） 加大样品密度，从而沉降到点样孔中。 3. 加样 ? 将 DNA 样品（ 5ul ）与 6 ×上样缓冲液（ 1ul ） 混匀后，用微量 加样枪小心加入样品孔内 。 ? 注意加样枪的枪头不可插入过深，以免刺穿凝胶，导致样品 外溢。 ? 每加完一个样品要 更换枪头 ，以防止样品污染 。 6X 上样缓冲液组分： 300 mM NaOH ， 6 mM EDTA ， 0.25% 溴酚蓝， 0.25% 二甲苯酚， 2.5% 聚蔗糖 作用（ 1 ） 指示显示电泳的进程。 （ 2 ） 加大样品密度，从而沉降到点样 孔中。 移液枪的正确使用 Filling the Wells 4. 电泳 ? 接通电源，一般红色为正极，黑色为负极，切记 DNA 样品 由负极往正极泳动 （靠近加样孔的一端为负）， 电压为 5 V/cm （长度以两个电极之间的距离计算） ? 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳 5. 结果观察 小心地取出凝胶槽，在波长 254nm 紫外灯下进行观察。 DNA 存在的位置呈现荧光。肉眼可观察到清晰的条带 。