mscs诱导成骨分化说明书 翻译版.docVIP

【成骨培养基】 OriCellTM间充质干细胞成骨分化培养基由优化的间充质干细胞(MSC)成骨分化基础培养基、细胞培养补剂和预选胎牛血清组成。 基础培养基 175 mL 胎牛血清 20 mL 青霉素-链霉素 2 mL 谷氨酰胺 2 mL 抗坏血酸盐 400 uL β-甘油磷酸盐 2 mL 地塞米松 20 uL 茜素红S 10 mL 一、完全培养基的制备 1. 使用前，将符合MSC标准的胎牛血清于2-80℃温度下隔夜解冻或完全解冻。轻轻旋转瓶子，确保均匀。血清已热灭活，解冻后即可使用。 注:解冻血清中可能含有絮状沉淀物。血清中这些物质的存在不会改变产品的性能特征。不建议通过过滤血清来去除这些沉淀。因此，可能会导致一些血清营养素的损失。 2. 使用前约30分钟，室温解冻抗坏血酸盐、β-甘油磷酸盐、青霉素-链霉素溶液、谷氨酰胺溶液。轻轻倒瓶几次，确保均匀。 3. 使用前约10分钟，在室温下解冻地塞米松。 注:取下瓶盖前，先低速离心，以保证全部内容物的回收。 4. 用70% v/v乙醇对试剂盒中每个组件的瓶/瓶外表面消毒，让乙醇蒸发。 5. 无菌打开层流罩内的瓶子/小瓶。 6. 转移全部抗坏血酸，β-甘油磷酸盐，胎牛血清、青霉素-链霉素溶液、谷氨酰胺溶液进入MSC成骨分化基础培养基。 7. 用少量基础培养基清洗每个小瓶/瓶。然后将漂洗液倒回基培养基瓶中。 8. 转移全部地塞米松量，向瓶中加入0.5 mL的培养基，用吸管混合，再将整个混合物倒回基础培养基瓶中。 9. 重复几次步骤8。 10. 轻轻旋转全部补充(完全)的培养基，以确保混合物均匀。现在可以使用完整的培养基了。 注:虽然本试剂盒中的每个组件都是无菌提供的，但强烈建议过滤完全培养基。 二、组织培养血管明胶涂层 1. 在培养皿中加入0.1%的明胶溶液，完全盖住培养基。 2. 旋转，直到凝胶溶液均匀地覆盖整个容器底部。在室温下放置30分钟。 3. 将所有明胶溶液吸出，并在层流罩/生物安全柜内打开的容器中放置不超过30分钟，使残留的明胶溶液蒸发。 4. 待培养容器干燥后，将其密封。 三、成骨（六孔板） 1. 将OriCellTM MSCs在37℃的OriCellTM MSCs培养基中，5% CO2加湿培养箱中培养。 2. 当细胞约80-90%融合时，可与0.25%胰蛋白酶- 0.04% EDTA分离。 3. 将生长培养基中的MSC以2×104细胞/cm2的密度重新播种在预涂0.1%明胶溶液的6孔板中。 4. 在37℃、5%的CO2加湿培养箱中孵育细胞。 5. 当细胞融合约60-70%时，小心地吸取生长培养基，加入2 mL OriCellTM间充质干细胞分化培养基。 6. 用新鲜的OriCellTM间充质干细胞成骨分化培养基（37℃预热）每3天换液一次，持续2-4周。 7. 分化2-4周后，细胞固定，用茜素红S染色。 注:为防止成骨细胞脱离，建议分析前每2天更换半份培养基。 四、茜素红S染色分析 1. 细胞分化完成后，取出成骨分化培养基，用1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗。用2 mL 4%甲醛溶液固定细胞30分钟。 2. 用1x PBS冲洗两次。用1ml茜素红S液对细胞染色3-5分钟。 3. 用1x PBS冲洗2-3次。 4. 细胞现在可以在显微镜下观察和分析。 五、稳定和储存 所有产品应存放在暗处。MSC成骨分化基础培养基和茜素红S在2-8℃稳定1年，其他在-20℃下可稳定两年。这些产品应在标签过期后丢弃。配置好的完全培养基可以在2-8℃的暗处储存长达一个月。为获得最佳性能，应避免重复的温-冷和冻-融。