亲免蛋白CYP38互作蛋白At4g24930和At1g21500的功能探究.pdf

摘要 摘要 光合作用是自然界几乎一切生命生存和发展的物质基础。高等植物和一些藻类通 过特有的细胞器叶绿体(Chloroplast)完成这一生化反应以保证自身的生长需要。近年来 对叶绿体蛋白进行研究发现，大量存在于叶绿体中的类囊体蛋白也参与光合作用的过 程。亲免蛋白(immunophilins)作为免疫抑制剂的胞内受体在动物体中发现，介导免疫 抑制。亲免蛋白广泛分布于生物体中，其中在植物中数量最多。CYP38(Cyclophilin 38) 是拟南芥亲免蛋白家族中的一员，其对光合作用光系统Ⅱ(Photosystem II, PSⅡ) 的组装 及稳定性的维持有着重要的作用，但组装机制并不清楚。At4g24930 和At 1g21500 是 通过酵母双杂交筛选得到的 CYP38 的互作蛋白，那么这两个蛋白是否能帮助 CYP38 共同参与PSⅡ 的组装，或者它们自身的功能是否跟光合作用有关，目前还不清楚。所 以本论文主要是对 A t4g24930 和 A t1g21500 的功能进行初步的探究，同时确定其与 CYP38 功能之间的关系。 通过生物信息学分析可知，A t4g24930 含有 162 个氨基酸，成熟蛋白大小为 17.9 kDa ，理论等电点为5.06，未预测到特殊结构域。At1g21500 含有67 个氨基酸，成熟 蛋白大小为7.3 kDa ，理论等电点为10.06，未预测到特殊结构域。拟南芥eFP Brower 网站预测A t4g24930 和A t1g21500 基因主要在绿色组织器官中表达。进化分析表明拟 南芥A t4g24930 、A t1g21500 的同源物种很少，且都是高等植物，说明这两个基因在高 等植物光合作用方面可能有重要作用。为了研究该基因的功能，我们首先通过 CRISPR-Cas9 基因编辑技术并经过筛选分别得到了A t4g24930 和A t1g21500 基因的两 个不同株系的纯合突变体。 对A t4g24930 和A t1g21500 做了亚细胞定位和Western 分析，发现这两个基因都 位于叶绿体的类囊体腔中。通过体内酵母双杂交和体外Pull Down 验证了这两个蛋白 都能与CYP38 的C 端功能域互作。 在正常光及变光条件下，A t4g24930 突变体A t4g24930-m1 ，A t4g24930-m2 植株与 野生型无明显差别。但高光胁迫下叶片明显变紫，盐胁迫下叶片边缘发黄，表明植物 对高光、盐敏感。高光处理后，通过Blue Native PAGE 观测到A t4g24930-m1 突变体 I 西北大学硕士学位论文 相比于野生型，C S M 条带减少，表明A t4g24930 基因在高光胁迫时，对于超级复合 2 2 2 体的富集有一定的影响，可能参与了植物响应高光的生理机制。 在正常光下，A t1g21500 突变体A t1g21500-m1 ，A t1g21500-m2 突变体与野生型相 比晚抽薹3 天，变光条件下晚薹更明显。高光胁迫下花青素含量测定结果与野生型无 明显差异。通过Blue Native PAGE 检测正常光下的光合复合体，发现无明显变化。这 些结果表明，A t1g21500 可能影响植物生长。将这两个基因的单突变体分别与cyp38-2 突变体杂交得到纯合双突，发现植株矮小、叶片发黄、发育迟缓，在高光条件下致死。 以上通过对At4g24930 和 At1g21500 基因功能的初步探究，表明 At4g24930 和 At1g21500 与CYP38 确实存在互作，并且At4g24930 在高光下可能参与PSII 的组装， At1g21500 影响植物的生长，这两个基因可能通过某种方式共同影响拟南芥的光合效 率，同时为后续研究提供依据。 关键词：光合作用，高光敏感，晚花，类囊体 II 目录 摘要I ABSTRACT I