实验二乙酰胆碱酯酶抑制法快速测定果蔬中的残留农药概要.docxVIP

实验二 乙酰胆碱酯酶抑制法快速测定果蔬中的残留农药 目前有机磷、氨基甲酸酯类农药是我国大量使用的杀虫剂，虽然这类农药与过去使用的有机氯农药相比，降解速度较快，但在果蔬中的残留仍然较为严重。由于该类农药能抑制人体内乙酰胆碱酯酶的生理活性，神经传导因此受阻，引起神经麻痹乃至死亡，对人类健康造成极大危害。对于果蔬中的农药通常采用气相色谱等方法进行分析，但分析时间长，操作步骤烦琐，适用于实验室分析。长期以来在大部分果蔬市场中，通常采用乙酰胆碱酯酶抑制法进行快速检测，即以乙酰胆碱酯酶作为检测试剂，采用农药残留检测仪，根据乙酰胆碱酯酶活性变化的程度来测定果蔬样品中的残留农药。 一、 实验目的 1． 了解果蔬中残留农药的分析方法； 2． 掌握酶抑制分析方法的原理及操作方法； 3． 理解农药残留性评价的意义。 二、 实验原理 有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制昆虫中枢和周围神经系统中乙酰胆碱酯酶的活性， 造成神经传导介 质乙酰胆碱的积累，影响正常传导，使昆虫中毒致死，酶抑制法就是根据这一昆虫毒理学原理，对农药残 留进行检测。 以乙酰胆碱为底物，在乙酰胆碱酯酶（ ACHE ）的作用下，乙酰胆碱水解成胆碱和乙酸，胆碱和二硫 双对硝基苯甲酸（ DNTB ）产生显色反应，使反应液呈黄色（于 410nm 处有最大吸收峰） 。 根据酶促反应动力学原理， 在没有有机磷和氨基甲酸酯类农药存在时， 底物在酶的催化作用下发生水 解，反应速率可以用吸光度值随时间的变化率 K 0 来表示。当有机磷和氨基甲酸酯类农药加入到酶的显色 体系中时，农药抑制了酶的活性，影响显色体系的反应速度，此时体系吸光度随时间的变化率为 K t，则有 机磷和氨基甲酸酯类农药对酶的活性的抑制率 Y 的计算公式如下： K 0 K t 100% 吸光度 A 空白溶液 K0 Y K 0 K 0：空白样品的吸光度随时间变化曲 线的斜 率值 K t：样品溶液的吸光度随时间变化曲 样品溶液 Kt 线的斜 率值 其中 K 0 和 K t 都可通过以下过程进行推导和 计算。 在样品的测量过程，选取每隔等步长时间测 时间 t 定 一 次 吸光度值， 3 分钟内共测定 7 个数据点。设数据 点 如 下 表： t 1 2 3 4 5 6 7 A A 1 A 2 A 3 A 4 A 5 A 6 A 7 则线性回归所得 A ～t 曲线的斜率 K 为： ti Ai 1 ti Ai 7 K 1 ( ti2 ti )2 7 (A1 2A2 3A3 4A4 5A5 6A6 7A7 ) 1(1 2 7) (A1 A2 A7 ) 7 (12 22 72 ) 1(1 2 7) 2 7 3(A7 A1) 2(A6 A2) (A5 A3 ) 28 3 lg( I 0 I 1 ) 2 lg( I 0 I 2 ) lg( I 0 I 3 ) I 7 I 0 I 6 I 0 I 5 I 0 28 3 lg( I 1 ) 2 lg( I 2 ) lg( I 3 ) I 7 I 6 I 5 28 由此结果可以看出， K 值的求取可以不需要使用 I 0 值，即实验中不需要使用蒸馏水来校正 I 0 值，在光源具有稳定性的 前提下（通过仪器的硬件电路实现） ， I0 值对测量结果不会有影响，这样就可以简化步骤，只用测出空白样品和实际样品溶 液的光强 I1－I 7，计算出 K 0 和 K t ，最后得出抑制率 Y 值。 采用乙酰胆碱酯酶测定残留农药时，当酶完全水解底物乙酰胆碱时，溶液显黄色，其抑制率为 0％， 当酶活性被农药抑制而部分水解乙酰胆碱， 测定溶液显淡黄色， 出现相应的抑制率， 当酶完全被农药抑制， 测定溶液显无色，抑制率为 100% ，这样就可以建立起农药残留量与酶活性抑制率之间的关系。因而可以 通过测定抑制率的大小来显示农药残留的毒性程度。样品的毒性等级分为：安全、低毒和高毒。毒性等级 和抑制率之间的关系如下： 表 4-4 抑制率和毒性等级的关系 抑制率 Y 毒性等级 20% 安全 20%～ 50% 低毒 50% 高毒 三、 仪器和试剂 1． 仪器 农药残留检测仪 1 台 天平（ 0.01g） 1 台 组织捣碎机 1 台 一次性手套 1 双 金属镊子 1 支 试管架 1 个 移液管架 1 个 20mL 离心试管 3 支 10mL 具塞试管 4 支 5mL 吸量管 5 支 1 mL 吸量管 3 支 （或移液枪（ 50-250μ L ） 1 套） 2． 试剂 提取液：将两袋粉剂倒入 500mL 瓶内，加入 510mL 蒸馏水，摇匀溶解后备用。 稀释液：将两袋粉剂倒入 250mL 瓶内，加入 100mL 蒸馏水，摇匀溶解后备用。 酶液：每瓶酶粉加 2.6mL 稀释液，摇匀后置 4℃备用，配