去乙酰化酶SIRT6在肝脏胆汁酸代谢中的作用研究.pdf

摘要 背景和目的： 胆汁淤积性肝病(Cholestatic liver disease，CSLD)是临床上常见的由胆汁的形 成、分泌以及排泄等障碍，导致胆汁在肝脏堆积，反流入血的一类代谢疾病。由 于病因多样、机制复杂等因素使CSLD 在机制研究上仍存在许多难题。去乙酰化 酶SIRT6 是哺乳动物Sirtuins 蛋白家族中的重要成员之一，具有高度保守的NAD+ 依赖性去乙酰化酶活性和ADP-核糖基转移酶活性。SIRT6 在机体中参与调节许 多重要的生理病理过程，而SIRT6 在肝脏中胆汁酸代谢及胆汁淤积所导致的肝脏 疾病的发生发展过程中的作用尚未报道。 研究方法： 在构建的肝细胞特异性敲除SIRT6 （SIRT6-LKO ）小鼠模型的基础上利用1% 胆酸 （CA ）饮食模拟胆汁淤积性肝病模型，探究去乙酰化酶 SIRT6 在胆汁酸代 谢中的作用。40 只8 周大小的雄性小鼠随机均分四组，给予标准饮食或添加1% CA 饮食10 天：WT 小鼠标准饮食组（WT 组）、SIRT6-LKO 小鼠标准饮食组（KO 组）、WT 小鼠CA 饮食组（CAWT 组）、SIRT6-LKO 小鼠CA 饮食组（CAKO 组）。通过血清指标分析、胆汁酸代谢关键酶的表达、肝脏形态等指标评价 SIRT6-LKO 对于肝脏胆汁酸代谢的影响。 结果： 1. 通过鼠尾基因型鉴定、肝脏SIRT6 的mRNA 和蛋白水平验证说明成功构 建SIRT6-LKO 小鼠模型； 2. 正常饮食条件下，肝脏 SIRT6 敲除小鼠的血清指标总胆汁酸（TBA ）、 总胆固醇（TC ）、总胆红素（TBIL ）、谷丙转氨酶（ALT ）、谷草转氨酶（AST ） 和胆汁酸合成酶 CYP7A1、CYP8B1 及胆汁酸转运蛋白 BSEP 、NTCP 和转录因 子FXR 的蛋白和mRNA 表达水平较野生型无显著差异（p 0.05 ）； 3. CA 饮食条件下，CAWT 和 CAKO 组小鼠的血清指标 TBA 均值分别为 18.21 μmol/l 和15.04 μmol/l，较正常饮食组（9.08 μmol/l 和8.87 μmol/l ）明显升 高（p 0.01 ）；CA 饮食组的肝脏合成酶CYP7A1、CYP8B1 的蛋白和mRNA 表 I 达水平较正常饮食组显著降低，转运蛋白BSEP 的蛋白和mRNA 表达水平明显 高于正常饮食组（p 0.05 ）。说明CA 饮食诱导的胆汁淤积模型构建成功。 4. CA 饮食条件下，CAWT 和 CAKO 组小鼠血清中的TC 均值分别为 3.32 mmol/l 和4.25 mmol/l ，CAKO 组小鼠血清的TC 水平较CAWT 组显著升高，且 差异具有统计学意义（p 0.05 ）。CAKO 组的转录因子FXR 的蛋白水平较CAWT 组明显降低，而这两组中其他血清指标（TBA 、TBIL、ALT 、AST ）和胆汁酸相 关蛋白（CYP7A1 、CYP8B1 、BSEP 、NTCP ）的表达无明显影响。说明在胆汁 淤积的条件下，肝脏中去乙酰化酶 SIRT6 的敲除降低 FXR 的蛋白表达，说明 SIRT6 可能影响转录因子FXR 的表达水平。 结论： 在正常生理条件下，肝细胞中 SIRT6 的敲除不影响肝脏中胆汁酸的代谢平 衡。在CA 诱导的胆汁淤积条件下，肝细胞中SIRT6 的敲除未起到缓解或者加重 胆汁淤积的作用，但SIRT6 的敲除明显降低了转录因子FXR 的蛋白水平，可能 对其的表达存在一定的调控作用。 关键词：SIRT6，胆汁酸代谢，胆汁淤积，FXR II 插图索引 图 1 SIRT6-LKO 小鼠基因型鉴定结果 23 图 2 SIRT6-LKO 小鼠基因型验证 24 图 3 血清中肝功能指标的变化 25 图 4 肝重和胆囊的大小 26 图 5 肝脏胆汁酸合成酶的表达变化 27 图 6 肝脏胆汁酸转运蛋白的表达变化 29 图 7 肝脏胆汁酸受体FXR 的表达变化 30 图 8 肝脏组织的HE 染色31