天根DP117-无内毒素质粒大提试剂盒说明书.docxVIP

PAGE PAGE # 天根DP1 1 7-无内毒素 质粒大提试剂盒说明书  产品简介 本试剂盒采用独特的硅胶模吸附技术，高效专一地结合质粒DNA。同时采 用特殊的溶液P4和过滤器CS1,可有效的出去内毒素、蛋口质朵志；整个提取 过程仅需lh,方便快捷。使用本试剂盒提取的质粒DNA可适用于各种常规操 作，包括酶切、PCR、测序、连接、转化和细胞转染多种细胞等试验。 推荐每次菌液使用量：高拷贝质粒推荐使用量为100ml,得率一般在500- 1500|ig左右；低拷贝质粒推荐使用量为200ml,得率一般在200-600ng左右。 注意事项：请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。 溶液P1在使用前先加入RNase A （将试剂盒中提供的RNase A全部加入）， 混匀，置于2-8°C保存。 第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在漂洗液PW中加入无水乙醇。 使用前先检查平衡液BL,溶液P2和P4是否出现结晶或者沉淀，如有结晶 或者沉淀现象，可在37°C水浴中加热儿分钟，即可恢复澄清。 注意不要直接接触溶液P2和P4,使用后应立即盖紧盖子。 使用过滤器时请将推柄小心缓慢地从过滤管中抽出，避免滤膜因压力而松 动。 提取的质粒量与细菌培养浓度，质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低 拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加P1、 P2、P4的用量；洗脱缓冲液推荐在65-70°C水浴中预热，可以适当延长吸附 和洗脱时间，以提高提取效率。 实验询使用平衡液BL处理吸附柱，可以最大限度激活硅基质膜，提高得 率。 用平衡液处理过的柱子最好立即使用，放置时间过长会影响使用效果。 质粒DNA浓度及纯度检测 得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。 OD260值为1相当于大约50ng/ml双链DNA。纯化的质粒DNA OD260/OD280 通常在左右，可直接应用于细胞转染其至动物体内实验等对DNA纯度要求很高 的实验中。 操作步骤： 柱平衡步骤：向吸附柱CP6中（吸附柱放入 柱平衡步骤：向吸附柱CP6中（吸附柱放入50ml收集 中）加入的平衡液 BL, 8000rpm （~8228xg）离心2min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新 放回收集管中。（用平衡液处理过的柱子最好立即使用）O 取100ml （根据培养菌体的浓度选择合适的量，低拷贝推荐用200ml）过夜 培养的菌液加入离心管,室温8000rpm （~8228xg）离心3min收集菌液，尽 量吸除上清。 注意：菌液较多时候可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中， 菌液量以能够充分裂解为佳，菌液过多会导致裂解不充分从而降低质粒的 提取效率。 尽量吸除上清，为确保上清液全部吸除，请用干净的吸水纸吸去瓶壁上的水 滴。 4?向留有菌体沉淀的离心管中加入8ml溶液P1 （请检査是否已加入 RNaseA）,使用移液器或涡旋振荡器彻底裂解悬浮细菌细胞沉淀。 注意：请务必彻底悬浮细菌沉淀，如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解 效果，导致提取量和纯度偏低，对于低拷贝质粒，加大菌体用量的同时按 比例增加Pl P2、P4的用量。 向离心管中加入8ml溶液P2,立即温和地上下翻转6~8次，室温放置 5min。 注意：温和地混匀，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA。此时菌液应变 得清亮粘稠，如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少 菌体量。 向离心管中加入8ml溶液P4,立即温和地上下翻转6~8次，充分混匀，至 溶液出现白色分散絮状沉淀。然后室温放置lOmin左右。SOOOrpm （~8228xg）离心5-10min,使口色沉淀离至管底（可适当增加离心时 ，将全部溶液小心倒入过滤器CS1中（请避免倒入大量沉淀而阻塞过滤 器），慢慢推动推柄过滤，滤液收集在干净的50ml的管中（自备）。 注意：加入溶液P4后应立即混匀，避免产生局部沉淀。如果离心后倒入过 滤器CS1中的溶液有白色沉淀也不会影响过滤，如果菌体过多（100ml）,推 荐延长离心时间至20-30mino 向滤液中加入倍滤液体积的异丙醇（加入异丙醇过多容易导致RNA污 染），上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP6中（吸附柱放入50ml收集管 中）。 注意：过滤后滤液会损失，根据损失的不同请加入不同体积的异丙醇，吸 附柱CP6的最大容积为15ml,所以需要分2次过柱。 室温8000rpm （~8228xg）离心2min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP6 重新放回收集管中。 注意：将第7步中所得溶液分2次过柱，每次均按以上条件操作。 向吸附柱CP6中加入10ml漂洗液PW (请先检査是否已加入无水乙醇), 8000rpm (~8228xg)离心2min,弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回 收集