基因工程2：操作技术.ppt

Chapter three Techniques of genetic engineering Chapter three 六 . Different ramificate( 衍生的） methods of PCR 1 、热启动 PCR 是除了好的引物设计之外，提高 PCR 特异性最 重要的方法之一。 原因：尽管 Taq DNA 聚合酶的最佳延伸温度在 72 ℃ ，聚 合酶在室温仍然有活性。因此， PCR 反应体系配制过程中， 以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特 异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。 对策： ? 限制 Taq DNA 聚合酶活性的常用方法是在冰上配制 PCR 反 应液，并将其置于预热的 PCR 仪。这种方法简单便宜，但并 不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物 的扩增。 Chapter three ? 热启动通过抑制一种基本成分延迟 DNA 合成，直到 PCR 仪达到变性温度。 包括延缓加入 Taq DNA 聚合酶 ; 使用蜡防护层将 一种基本成分，如镁离子或酶，包裹起来，或者将 反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热 循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在 一起 ; 聚合酶的活性需经过 95 ℃ 10mins 的 高温造成化学修饰基团的脱落，然后才有聚 合的活性 . Chapter three 2 、 Touch-down PCR ? Touch-down PCR 又称降落 PCR 。即选定一个温度范 围，如 65 — 50 ℃ ，每降 1-2 ℃ 进行 1-2 个循环，然后 在 50 度下进行 15 个循环。 ? Touch-down 的原理：随着退火温度的降低，特异 性逐步降低，但特异性条带在温度较高时已经扩增出 来，其浓度远远超过非特异性条带，随着退火温度的 降低，特异性条带优先被扩增。 ? 选择初始复性温度的原则：起始复性温度应该比引 物的 Tm 值高出 5-10 度，然后每个循环递减 1-2 度 Chapter three Touch-down PCR 的应用范围 ? low copy of targeted DNA; ? high degree degeneracy (or less specific) of the set of primers; ? RT-PCR using oligo-dT. Chapter three 3 、巢氏 PCR （ Nested PCR ） ? 巢氏 PCR 需要两到三对引物，一般采用第一套引物扩增 15-30 个循环，再用扩增 DNA 片段内设定的第二套引物扩 增 15-30 个循环，这样可使待扩增序列得到高效扩增，而 次级序列却很少扩增。套式引物 PCR 减少了引物非特异性 退火，从而增加了特异性扩增，提高了扩增效率。 ? 若将巢氏 PCR 的内外引物稍加改变，延长外引物长度 （ 25-30bp ），同时缩短内引物长度（ 15-17bp ），使外 引物先在高退火温度下复性，做双温扩增，使内引物在外 引物扩增的基础上，在低退火温度复性，直到扩增完成， 这样就可以使两套引物一次同时加入。 Chapter three 4 、原位 PCR ? 原位 PCR 就是在组织细胞里进行 PCR 反应，它结合了具有细胞定位能力的原位 杂交和高度特异敏感的 PCR 技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一 项有较大潜力的新技术 . ? 原位 PCR 是 Hasse 等于 1990 年建立的，实验用的标本是新鲜组织、石蜡包埋组 织、脱落细胞、血细胞等 . ? 其基本方法为①固定细胞 : 将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上，并 用多聚甲醛处理，灭活除去细胞内源性过氧化物酶 . ②蛋白酶 K 消化处理 : 用 60ug/ml 的蛋白酶 K 将固定好的组织细胞片 55 ℃ 消化处理 2h 后， 96 ℃ 2min 以灭 活蛋白酶 K. ③ PCR 扩增 : 在组织细胞片上，加 PCR 反应液，覆盖并加液体石蜡后， 直接放在扩增仪的金属板上，进行 PCR 循环扩增 . 有的基因扩增仪带有专门用于 原位 PCR 的装置 . ④杂交 :PCR 扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂 交 . ⑤显微镜观察结果 . ? 原位 PCR 既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置， 于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转归有重大的实 用价值 . 其特异性和敏感性高于一般的 PCR. Chapter three Chapter three 6 、免疫 -PCR(immuno-PCR) ? 免疫 -PCR(immuno-PCR) 是新近建立的一种灵敏、特异的抗 原检测系统 .