羊传染性胸膜肺炎培养基、生长抑制试验、代谢抑制试验、直接免疫荧光抗体试验.docxVIP

附录A (规范性附录) 培养基 A.1 改良Hartley氏消化汤培养基(液体培养基） 胰蛋白胨8g，灭菌Hartley氏消化汤600mL，灭菌0.5%水解乳蛋白Hank，s液1000mL，0.4%酚红20mL，混匀，加青霉素至200IU/mL，用3.5% NaHCO3调节pH至7.6，用单板式滤器过滤除菌后,加入无菌灭能的猪血清400mL，分装于10mL玻璃瓶中，放入37℃普通温箱做杂菌检验，待无菌生长便可使用。 A.2 改良Hartley氏琼脂培养基（固体培养基） 改良Hartley氏消化汤培养基中加入琼脂，使其含量达1.3%～1.5%，经121 kPa高压灭菌30min即成。 A.3 增菌培养基 马丁肉汤加20%马血清和3g/100mL酵母浸膏。 A.4 选择性培养基 增菌培养基内加80:1的1%醋酸铊和青霉素200IU/mL；制作平板时加1%国产琼脂。 附录B（规范性附录）生长抑制试验 B.1 材料 液体培养基：配制方法件附录A.1； 不同支原体阳性血清：丝状支原体丝状亚种、丝状支原体山羊亚种、山羊支原体山羊肺炎亚种、绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体； 滤纸。 B.2 操作步骤 将鉴定菌株24h培养液摇匀，取0.25mL滴于平板上，用L型玻棒将其均匀涂抹于培养平板表面后，用分别浸取了4倍稀释的不同支原体阳性血清、直径7mm的定性滤纸片分别贴附于平板表面，每块平板贴3～4片，37℃培养24h～48h。观察并记录抑菌圈大小。每株待检菌株作3次，求平均值。 B.3 结果判定 抑菌圈直径2mm或以上者判为阳性。 附录C（规范性附录）代谢抑制试验 C.1 材料 选择性培养基：配制方法见附录A.4； 葡萄糖； 酚红； 标准阳性血清； 阴性血清。 C.2 步骤 将含葡萄糖和酚红指示剂，pH值为7.6的支原体选择性培养基分装为每支试管1mL，在第1试管中加入阳性血清1mL，充分混匀后取1mL移入第2管，照此类推至第8管。再向每管中加入上述培养基1mL，充分摇均，使管内阳性血清成对倍稀释序列22、23、24、25、26、27、28、29，每管加入被鉴定菌株48h培养菌液0.02mL。各组设不加菌液和加有阴性血清的对照管各1支，37℃培养3d～14d,每天观察，待颜色出现明显变化时，记录颜色变化，并测各管pH值。其操作见表C.1。 表C.1 羊传染性胸膜肺炎代谢抑制试验操作方法 C.3 步骤 以pH值下降0.5单位以内的最高血清稀释倍数为抑制的判定依据。 附录D（规范性附录）直接免疫荧光抗体试验 D.1 试剂 磷酸缓冲液（PBS）； 标准抗羊传染性胸膜肺炎的荧光抗体。 D.2 器材 荧光显微镜； 载玻片； 盖玻片； 恒温箱。 D.3 步骤 D.3.1 样品制备 取长好单个菌落的琼脂平皿培养物，加入约5mL的PBS，置室温0.5h，吸弃PBS，再用铲刀切取琼脂培养物，置于载玻片。 D.3.2 染色 将稀释至工作浓度的荧光抗体，滴加在待检标本面上，室温恒湿染色30min，取PBS轻洗琼脂表面数次，荧光显微镜观察。同法用荧光抗体滴加阳性及阴性标本面，染色观察。 D.4 判定标准 被检标本的细菌结构完整清晰，并在阳性、阴性对照均成立时判定。在菌体中见到特异黄绿色荧光者判为阳性；如果所有菌体中无特异性荧光者判为阴性。