动物微生物与免疫技术 任务六 细菌标本片的制备及染色法 实训二细菌标本片的制备及染色法.pptVIP

项目二 细菌病的实验室诊断实训二 细菌标本片的制备及染色法 抹片 　根据所用材料不同，抹片的方法亦有差异。 固体培养物 　取洁净的玻片一张，把接种环在酒精灯火焰上烧灼灭菌后，取1～2环的无菌生理盐水，放于载玻片的中央，再将接种环灭菌，冷却后，从固体培养基上挑取菌落或菌苔少许，与水混匀，作成直径1cm的涂面。接种环用后需灭菌。 液体培养物 　可直接用灭菌接种环钩取细菌培养液1～2环，在玻片上作直径1cm的涂面。 液体病料（血液、渗出液、腹水等）　取一张边缘整齐的载玻片，用其一端醮取血液等液体材料少许，在另一张洁净的玻片上，以45°角均匀推成一薄层的涂面。 组织病料 　 以无菌剪刀、镊子剪取被检组织一小块，以其新鲜切面在玻片上做3～5个压印或涂抹成适当大小的一薄层。 干燥 　涂片应在室温下自然干燥，必要时将涂面向上，置火焰高处30～40 cm处微热干燥。 固定 　固定的方法因染色方法不同而异。 火焰固定　是最常用的方法，将干燥好的抹片涂面向上，在火焰上来回通过数次（一般4～6次），以手背触及玻片微烫手为宜。 化学固定　有的血片、组织触片用姬姆萨染色时，要用甲醇固定3～5min。 细菌培养物涂片及革兰氏染色 病料触片及美兰染色 实验目标 通过观察病料中是否有菌，从而初步判断病料是否取自细菌感染病例。 若病料中有菌，根据细菌形态初步鉴定其种类 实验器材 酒精灯、接种环、载玻片、吸水纸、生理盐水、美蓝染色液、革兰氏染色液、瑞氏染色液、染色缸、染色架、洗瓶、显微镜、香柏油、乙醇乙醚、擦镜纸、细菌培养物(大肠杆菌、葡萄球菌等)、细菌病料、镊子、剪刀、标记笔等 病料中细菌的形态学检查方法 病料中细菌的形态学检查方法 病料中细菌的形态学检查方法 病料中细菌的形态学检查方法 形态学检查结果及诊断结论 * 项目二 细菌病的实验室诊断---细菌标本片的制备及染色法 学习目标 能利用不同的材料进行细菌标本片的制备 会进行常规染色 能认识细菌的不同染色特性 仪器材料 　酒精灯、接种环、载玻片、吸水纸、生理盐水、革兰氏染色液、染色缸、染色架、洗瓶、显微镜、香柏油、乙醇乙醚、擦镜纸、细菌培养物(大肠杆菌、葡萄球菌等)等。 方法步骤 细菌标本片的制备步骤： 抹片 干燥 固定 常用的细菌染色方法： 美蓝染色法 革兰氏染色法 瑞氏染色法 姬姆萨染色法 染色---美兰染色法 在经火焰固定的抹片上，滴加适量美蓝染色液覆盖涂面，染色2～3min，水洗。 晾干或吸水纸轻压吸干镜检。 菌体呈蓝色。 病料中的炭疽杆菌（美蓝染色） 染色---革兰氏染色法 在固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液，染1～2 min，水洗。 加革兰氏碘液媒染，作用1～2min，水洗。 加95％酒精脱色约30s至1min，水洗。 加稀释石炭酸复红或沙黄水溶液复染30s左右，水洗，吸干后镜检。 革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。 葡萄球菌（纯培养，革兰氏染色） 大肠杆菌（纯培养，革兰氏染色） 染色---瑞氏染色法 细菌抹片自然干燥后，滴加瑞氏染色液于涂片上以固定标本，1～3min。 再滴加与染色液等量的磷酸盐缓冲液或中性蒸馏水于玻片上，轻轻摇晃使与染色液混和均匀，5min左右水洗。 晾干后镜检。 菌体呈蓝色，组织细胞的胞浆呈红色，细胞核呈蓝色。 病料中的巴氏杆菌（瑞氏染色） 染色---姬姆萨染色法 血片或组织触片自然干燥后，用甲醇固定3～5min。 干燥后在其上滴加足量染色液或将抹片浸入盛有染色液的染缸里，染色至少30min，取出水洗。 吸干或烘干，镜检。 细菌呈蓝青色，组织细胞浆呈粉红色，细胞核呈蓝紫色。 干燥 2 固定 3 革兰氏染色 4 涂片 1 细菌培养物涂片及革兰氏染色 　　固体培养物 取洁净的玻片一张，把接种环在酒精灯火焰上烧灼灭菌后，取1～2环的无菌生理盐水，放于载玻片的中央，再将接种环灭菌，冷却后，从固体培养基上挑取菌落或菌苔少许，与水混匀，作成直径1cm的涂面。接种环用后需灭菌。 干燥 2 固定 3 革兰氏染色 4 涂片 1 室温下自然干燥或将标本片的涂面向上，置酒精灯火焰高处微烤加热干燥。 细菌培养物涂片及革兰氏染色 干燥 2 固定 3 革兰氏染色 4 涂片 1 细菌培养物涂片及革兰氏染色 火焰固定：将干燥好的标本片涂面向上，在酒精灯火焰上通过3～4次，以手背触及玻片微烫手为宜。 干燥 2 固定 3 革兰氏染色 4 涂片 1 细菌培养物涂片及革兰氏染色 1. 草酸铵结晶紫 水洗 1~2min 2. 革兰氏碘液 水洗 1~2min 3. 95%酒精 水洗 0.5~1min 4. 稀释石炭酸复红 水洗 20~30s 培养物涂片镜检结果示例 大肠杆菌： G-； 多散在； 杆菌。 病料 标本片 镊子 剪刀 酒精灯 干燥 2 固定 3 美兰染色 4 触