OVOL1和OVOL2在DNA损伤修复和雄性减数分裂中的功能及机制研究.pdfVIP

浙江大学博士学位论文 中文摘要 主要研究结果： 1. 生物信息学分析表明人与小鼠的OVOL1 和OVOL2 高度同源，同源性分别 为96%和88%。无论人源还是鼠源的OVOL1 和OVOL2 均有4 个锌指结构组成的 结构域，都有DNA 结合和调控基因转录的功能。 2. 成功构建了基因敲除小鼠分别获得了 OVOL1 和 OVOL2 的单独敲除小鼠 胚胎干细胞，以及OVOL1 和OVOL2 双敲除小鼠胚胎干细胞。使用Stra8-GFPCre 工具鼠，特异性地在生殖细胞中敲除Ovol1 和Ovol2 基因。 3. 在HeLa 细胞中用 Laser 诱导DNA 损伤后，OVOL1 和OVOL2 都能聚集 在 DNA 损伤位点。通过串联亲和纯化试验发现 OVOL1 和 OVOL2 能够与参与 DNA 损伤修复的蛋白 RPA 复合体结合，用免疫共沉淀检测点突变的 OVOL1 和 OVOL2 发现，它们都是通过靠近C 端的三个锌指结构域和RPA 复合体结合。 4. 通过免疫印迹实验发现，小鼠胚胎干细胞中缺失OVOL1 或OVOL2 后并不 会影响 RPA 复合体与染色体的结合能力，免疫荧光实验发现缺失 OVOL1 或 OVOL2 也不影响RPA 在DNA 损伤位点附近聚集。之后的免疫印迹实验显示，缺 失了OVOL1 或OVOL2 后小鼠胚胎干细胞中CHK1 的磷酸化受到影响，并通过流 式细胞术分析发现缺失了OVOL1 或OVOL2 后不能有效激活G2/M 细胞周期检查 点，细胞DNA 损伤修复过程发生延迟，最终造成染色体异常。 5. OVOL1 或OVOL2 缺失的雄性小鼠能够正常生育，其附睾中有成熟精子产 生，其睾丸大小和重量与对照组相比没有明显差异，且雄性小鼠生殖细胞减数分裂 进程未发现异常。 结论：缺失OVOL1 或OVOL2 会造成小鼠胚胎干细胞中DNA 损伤修复的 缺陷。OVOL1 和OVOL2 通过与RPA 的结合参与细胞DNA 损伤修复过程，并在 维持小鼠胚胎干细胞的基因组稳定性中起重要作用。OVOL1 或OVOL2 的缺失不 会影响小鼠的精子发生和减数分裂进程。 关键词：OVOL1 ，OVOL2 ，DNA 损伤修复，精子发生，雄性减数分裂 III 浙江大学博士学位论文 英文缩略语表 英文缩略语表 缩略词 英文全称 中文全称 Alt-NHEJ Alternative-nonhomologous end-joining 选择性非同源末端连接 ATM Ataxia telangiectasia mutated 共济失调性毛细血管扩张症 突变基因 ATR Ataxia telangiectasia and Rad3 related 共济失调性毛细血管扩张症 和Rad3 相关 ATRIP ATR interacting protein ATR 相互作用蛋白 BER Base excision repair 碱基切除修复 BRCA1 Breast cancer 1, early onset 乳腺癌易感基因1 BRCA2 Breast cancer 2, early onset 乳腺癌易感基因2 CDK Cyclin-dependent kinases