G蛋白偶联受体介导的蛋白激酶C激活及其下游信号通路机制研究.pdfVIP

摘要 20 世纪80 年代，蛋白激酶C （PKC ）因其作为一种二酰甘油敏感的酶，同 时也是强效促肿瘤因子佛波酯的“受体”而引起人们的广泛关注。PKC 的发现解决 了科学界长达25 年的疑问，即促进脂质水解的激动剂是怎样去改变细胞生理活 动的。PKC 属于丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶家族，其活性的控制是通过自抑制假底 物的可逆释放来实现的。G 蛋白偶联受体（GPCRs ）在激动剂的作用下，可以将 胞外信号传递至胞内，引发一系列生理活动，其中尤为重要的一个方面就是可以 通过PKC 激活胞外信号调节激酶（ERK1/2 ），从而调节细胞分化、有丝分裂、增 殖等，甚至是一些异常的生理过程，如肿瘤的发生等。因此，进行GPCRs 介导 的蛋白激酶C 激活机制及其下游信号通路机制的探究尤为重要。 首先，本文的研究用生物信息学的方法在刺参（Apostichopus japonicus ）基 因组数据信息中挖掘得到Kisspeptin 及其受体的相关基因，并进行功能性鉴定和 研究分析。编码AjKiss 前体的基因可以翻译得到一条长为 180 个氨基酸的前体 肽，可以进一步水解产生两条成熟的C 末端酰胺化多肽，即AjKiss1a （32 个氨 基酸）和AjKiss1b（18 个氨基酸）。另外，两个AjKiss 受体（AjKissR1 和AjKissR2 ） 的cDNA 序列信息在A. japonicus 的基因组中被找到并在卵巢组织中被克隆得到。 功能性实验分析结果表明，AjKissR1 和 AjKissR2 均能很好地表达和定位在 HEK293T 细胞的细胞膜上，并在AjKiss1a 和AjKiss1b 的作用下可以快速动员胞 内钙离子，但呈现一定的配体选择性（AjKiss1a 倾向作用于AjKissR2 ，AjKiss1b 倾向作用于AjKissR1 ）。此外，AjKissR1/2 在AjKiss1a/b 的作用下，都能发生明 显内吞，以及介导Gαq-PLC 依赖的信号通路途径。进一步的研究发现，AjKiss1b 的C 末端核心10 肽片段，即AjKiss1b-10，均能激活AjKissR1/2 ，引起受体内吞 发生，以及 Gαq-PLC 依赖的 Ca2+ 信号通路和 ERK1/2 信号通路的激活。在 AjKiss1b-10 的作用下，AjKissR1 和AjKissR2 均能通过Gαq-PLC-Ca2+/PKC 信号 通路激活ERK1/2 ，另外，AjKissR1 还能够偶联Gαi/o 并通过Gβγ 依赖的方式激 活PKCε ，进而对ERK1/2 的激活做出贡献。 其次，本文的研究在先前工作（家蚕CAPAPVK 受体相关研究）的基础上首 次发现了可变剪接产生的天然剪接变体BomCAPAPVK-R1△341 是CAPA-PK 的 特异性受体。BomCAPAPVK-R1 基因由七个外显子组成，其中第七个外显子的丢 IV 失致使C 末端截短的剪接变体△341 的产生。C 末端的截短不仅影响了△341 的 膜定位，同时也影响了GRKs 依赖的受体内吞发生。之前我们关于R1 的研究表 明，和常见的 GPCRs 剪接变体类似，△341 可以作为负调节蛋白对野生型受体 R1 的膜定位和功能等方面产生影响，但其本身并不能被 CAPA-PVKs 激活。而 在本研究中，我们惊喜地发现△341 能被另一相近家族神经肽 CAPA-PK 特异性 激活。进一步的功能性实验分析结果表明，不同于 Gαq 偶联的野生型受体 R1 ， △341 是通过偶联Gαi/o 来介导腺苷酸环化酶的抑制和胞内cAMP 的下调，以及 通过Gβγ-PI3K-PKCζ 信号通路来介导ERK1/2 的磷酸化。 综上所述，本文的研究发现首次揭示了Kisspeptin 神经肽信号系统在非脊索 动物物种中的存在和功能，并探究了其可能介导信号通路机制，为下丘脑神经分 泌系统的古老起源提供了有力证据，也为无脊椎动物神经肽相关的研究提供了重 要的参考。而对天然剪接变体△341 的研究则为在家蚕中区分CAPA-PK 和CAPA- PVK 神经肽信号系统的作用提供了有力的证据，进一步说明了单个GPCR 基因 能够产生多种结构和功能上更为独特的蛋白亚型，明确