淫羊藿素对三种人肿瘤细胞增殖抑制机制的比较研究.docxVIP

PAGE PAGE # 淫羊藿素对三种人肿瘤细胞增殖抑制机制的比较研究 张淑琴1李沙沙2郑倩2黄佳彬2杨广笑2何光源2陈明洁2* （1武汉市六医院，江汉大学附属医院； 2科技部国际科技（基因工程）合作基地，华中科技大学生命科 学与技术学院） 摘要： 目的 比较淫羊藿素对人肝癌 HepG2细胞、人肺癌 A549人肾癌细胞786-0等三种人肿瘤细胞增 殖的抑制效果，并探索其作用机理。 方法通过MTT法比较淫羊藿素对 HepG2 A549、786-0肿瘤细胞增殖 的影响，流式细胞仪检测并确定淫羊藿素对肿瘤细胞凋亡的影响。 Western blot法检测淫羊藿素处理前后 细胞增殖和凋亡相关蛋白合成的变化。 结果淫羊藿素均时间和浓度依赖性地抑制三种人肿瘤细胞的增 殖，其中对人肾癌细胞 786-O的抑制效果最为明显；淫羊藿素促进三种肿瘤细胞凋亡；抑制周期相关蛋白 cyclin A、cyclinD1、cyclinE、CDK2和抗凋亡蛋白 Bcl-2的表达，提高促凋亡蛋白 Bax的表达。 结论淫 羊藿素在体外能明显抑制三种人肿瘤细胞的增殖，诱导其凋亡，对 786-O效果最为显著；它通过调节细胞 增殖和凋亡相关蛋白的表达来完成。 关键词：淫羊藿素；人肝癌 HepG2细胞；人肺癌 A549；人肾癌细胞786-O;增殖；凋亡；机制 淫羊藿为小檗科淫羊藿属多年生草本植物， 是中药方剂中常用到的一味中药， 具有温肾 壮阳、强筋骨、祛风湿的功能，用于治疗肾虚阳痿、宫冷不孕、风湿痹痛等多种疾病。淫羊 藿素Icaritin 为淫羊藿的主要成分，研究发现，淫羊藿素具有多种药理作用，如保护神经 系统［1］、启动心脏分化［2］、改善骨损伤［3］、提高免疫力⑷、抗肿瘤［5, 6］等多种功效。目前从植 物中寻找新型高效低毒的抗癌药物已经成为当今新药研制的热点， 迄今为止，淫羊藿素已被 用于抗乳腺癌、肝癌、子宫内膜癌、慢性粒细胞白血病等多方面的研究 ［5-8］，取得了较好进 HepG2细胞、人肺癌 A549、人 凋亡的影响，检测细胞中生长、凋 为淫羊藿素抗肿瘤新药的研制奠定 HepG2细胞、人肺癌 A549、人 凋亡的影响，检测细胞中生长、凋 为淫羊藿素抗肿瘤新药的研制奠定 1实验材料 1.1试剂 淫羊藿素购自上海融禾医药有限公司，胰蛋白酶（ Typsin ）、MTT以及DMSO均 购自Sigma公司。无支原体胎牛血清购自杭州四季青公司，青霉素 -链霉素溶液购自安特捷 生物技术有限公司。Ann exi n-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限 公司，GAPDH CDK2 cyclin A、cyclinD1、cyclinE、Bax、Bcl-2 等多克隆抗体购于 Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体购于武汉博士德生物工程公司。 1.2细胞培养 人肝癌细胞系 HepG2和肺癌细胞系 A549购自中国典型培养物中心 CTCC人 肾癌细胞系786-O购自美国典型培养物中心 ATCC三种细胞系均用含 10%无支原体胎牛血 清和1%双抗（青霉素-链霉素溶液）的 DMEM高糖培养基，37C、5% CO的细胞培养箱中培 养。 2方法 2.1细胞增殖测定 采用MTT （噻唑蓝）法检测细胞增殖。细胞培养至对数生长期，消化计 数，接种至96孔板2 X104个/孔，待细胞贴壁后，更换含有不同浓度淫羊藿素的新鲜培养基， 继续培养24h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20此，孵育4 h后弃上清，每孔加入 100此 DMSO 37C暗培养15 min后，于490nm测定光吸收值，以完全培养基为空白对照。细胞增 殖率=（处理组吸光值/对照组吸光值）x 1OO%。 2.2细胞凋亡检测采用AnnexinV-FITC/PI双染法和流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡。 细胞培 养至对数生长期，消化计数，接种至 6孔板2X105个/孔，细胞贴壁后，更换含有淫羊藿素 的新鲜培养基处理一定时间后，收集细胞、 PBS洗涤、500此缓冲液重悬细胞，加入 5此 AnnexinV-FITC和10此PI，混匀后室温避光孵育 15 min，于I h内用流式细胞仪检测。 2.3蛋白表达分析 采用Western Blot检测与细胞生长和凋亡相关的蛋白表达情况 。细胞培 基金项目：武汉市科技攻关计划 （201260523185），国家科技部国际科技合作项目（ 2009DFB20290第一作者：张淑琴（1967-），女，副主任医师，研究方向：神经免疫与变性病， 430015，E-mail : ltp670910@163.com 通讯作者：陈明洁（1968-），女，副教授，硕导，研究方向：生化与分子生物学， 430074, E-mail : cmj@ 5 养至对数生长期，消化计