生化试验技术离子交换总结.ppt

生物化学实验技术 生化实验技术课安排 1 、层析技术（台桂花） 离子交换层析分离纯化抗体（ 2 天） 2 、电泳技术（台桂花） SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳（可用于抗体 分离纯化过程的检测）（ 1 天） 3 、免疫检测技术（王桂云） 酶联免疫和双向免疫扩散（ 2 天） 4 、多糖分离和鉴定技术（周义发、魏民） 中草药多糖的分离提取和理化性质研究 （ 2-4 周，） 生化实验技术课安排 时间： 根据实验内容和学生时间安排 实验报告： 根据实验内容确定 生化实验技术课成绩评定 ① 平时成绩：占 50 分，包括出勤情况，课 堂表现（态度、动手能力和实验结果）， 实验报告等。 ② 期末考试：占 50 分，以口试方式，在实 验室进行，学生按抽签，分别到指定教 师处考试。考试内容为本课程所涉及的 实验原理、实验设计、动手操作、结果 分析、注意事项等。 层析（ chromatography ）简介 纸层析 薄层层析 柱层析 气相色谱 液相色谱 （常规液相 / 高效液相） 凝胶过滤 （分子筛层析） 离子交换层析 亲和层析 疏水作用层析 等等 种类 离子交换柱层析 离子交换层析 (Ion Exchange Chromatography) ： 一种吸附层析技术，根据分子极性的差异而进 行分离。 用途：分析和制备各种极性物质（例如蛋白质、 核酸、多糖、及其单体和寡聚物） 离子交换 阳离子交换 阴离子交换 强阳离子交换 弱阳离子交换 强阴离子交换 弱阴离子交换 1 、种类 组成 ： 固体支持物 (insoluble matrix) 带电基团 (charged groups) 平衡离子 (counter-ions) 2 、离子交换剂 (Ion Exchanger) （ 1 ）固体支持物（ insoluble matrix) 固体支持物： 无机化合物，例如羟基磷灰石 合成树脂，例如聚苯乙烯二乙烯苯 合成高聚物，例如 MonoBeads 、 SOURCER 多糖，例如葡聚糖、琼脂糖、纤维素 固体支持物决定了以下层析性质： 柱效（ efficiency) 容量 （ capacity) 回收率（ recovery) 化学稳定性（ chemical stability) 机械强度（ mechanical strength) 流动性（ flow properties) （ 1 ）固体支持物（ insoluble matrix) 阳离子电荷基团 阴离子电荷基团 例如 CM 、 SP 、 S 例如 DEAE 、 QAE 、 Q （阴离子交换剂） （阳离子交换剂） 电荷基团以共价方式联到固体支持物上。不能通过转型改变带电基团。 （ 2 ）带电基团（ charged groups) 常见带电基团的化学结构： （ 2 ）带电基团（ charged groups) 带电基团决定了离子交换层析的种类： 阳离子交换 （强 / 弱） 阴离子交换 （强 / 弱） 带电基团决定了层析的基本性质： 哪种物质结合（ type ） 结合强弱 （ strength ） 结合多少（ capacity ） （ 2 ）带电基团（ charged groups) 阴离子 阳离子 例如 Cl - 、 OH- 例如 K+ 、 Na+ （阴离子交换剂） （阳离子交换剂） 平衡离子与带电基团的电荷相反。靠静电引力与带电基团结合 . 结合是可逆的，可以被其它离子所取代。 （ 3 ）平衡离子（ counter-ions) 1 2 3 4 5 平衡离子 待分离的两种物质 低盐洗脱 高盐洗脱 平衡 上样和吸附 洗脱（弱） 洗脱（强） 再生 / 平衡 3 、离子交换层析过程和原理 N a C l 浓 度 0 1.0 A 2 8 0 n m 上样 梯度洗脱 洗脱体积 再生 平衡 平衡 3 、离子交换层析过程和原理 — 洗脱曲线 ? 离子交换剂 ? 层析条件的选择 样品缓冲液和洗脱液的 pH 洗脱方式 流速 平衡离子 层析柱 样品体积 …… 4 、影响分离效果的因素 蛋白质是两性电解质， pH 影响其带电状态 4 、影响分离效果的因素 — pH 对蛋白质层析的影响 4 、影响分离效果的因素 — pH 对蛋白质层析的影响 阳离子交换层析常用缓冲液： 4 、影响分离效果的因素 — pH 对蛋白质层析的影响 阴离子交换层析常用缓冲液： 4 、影响分离效果的因素 — pH 对蛋白质层析的影响 ? 离子交换剂 ? 层析条件的选择 样品缓冲液和洗脱液的 pH 洗脱方式 流速 平衡离子 层析柱 样品体积 …… 4 、影响分离效果的因素 非梯度洗脱（ isocratic) ： 洗脱液不变 梯度洗脱 （ gradient) ： 洗脱液的 pH 或盐浓度逐渐增加 或降低 4 、影响分离效果的因素 — 洗脱方式的选择 连续梯度