bca测蛋白的具体操作步骤.docxVIP

???????????????????????医 料推荐??????????????????? . 原理 BCA 蛋白浓度测定试剂盒 (BCA Protein Assay Kit)是根据目前世界上最常用蛋白浓度检测方法之一 BCA法研制而成，实现了蛋白浓度测定的简单，高稳定性，高灵敏度和 高兼容性。检测浓度下限达到 25 微克 / 毫升，最小检测蛋白量达到 0.5 微克， 待测样品体积为 1～ 20 微升。 二 . 试剂盒组份 组 份 Cat: KGPBCA （ 250 assay 酶标板 /50assay 1mL 比色杯） 蛋白标准溶液（ 0. 5 μg/ μ）L 5 mL BCA 试剂 A 25 mL×2 BCA试剂 B 1mL 三 . 操作步骤 A． 酶标板操作 1. 标准曲线的绘制： 取一块酶标板， 按照下表加入试剂 孔号 0 1 2 3 4 5 6 7 蛋白标准溶 液（ μL） 0 1 2 4 8 12 16 20 去离子水（ μL） 20 19 18 16 12 8 4 0 对应蛋白含量（ μg） 0 0.5 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 孔号 0 1 2 3 4 5 6 7 蛋白质 0 1 2 4 8 12 16 20 溶液 （μL） 去离子 20 19 18 16 12 8 4 0 水（ μL） 相应蛋 0 0.5 1 2 4 6 8 10 白质含 量（ μg） 2. 根据样品数量，按 50 体积 BCA 试剂 A 加 1 体积 BCA 试剂 B（ 50:1）配制适量 BCA工作液，充分混匀； 各孔加入 200 μ L BCA工作液； 把酶标板放在振荡器上振荡 30sec，37℃放置 30 分钟，然后在 562nm 下比色测定。以蛋白含量（ μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线； 5. 稀释待测样品至合适浓度，使样品稀释液总体积为 20μL，加入 BCA 工作液 200 μL，充 分混匀， 37℃放置 30 分钟后，以标准曲线 0 号管做参比，在 562nm 波长下比色，记录吸光值； 6. 根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（ μg），除以样品稀释 液总体积（ 20μL），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单 位： μg/ μL）。 B． 分光光度计测定 1. 标准曲线的绘制： 各管按照下表加入试剂 孔号 0 1 2 3 4 5 6 7 蛋白标准溶液 （ μL） 0 5 10 20 40 60 80 100 去离子水（ μL） 100 95 90 80 60 40 20 0 对应蛋白含量（ μg） 0 2.5 5.0 1 ???????????????????????医 料推荐??????????????????? 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 根据样品数量， 按 50 体积 BCA 试剂 A 加 1 体积 BCA试剂 B（ 50:1）配制适量 BCA 工作液，充分混匀； 各管加入 1000 μ L BCA工作液； 4. 各管充分混匀， 37℃放置 30 分钟，然后在 562nm 下比色测定。以蛋白含量（ μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线； 5. 稀释待测样品至合适浓度，样品稀释液总体积为 100 μL，加入 BCA工作液 1000 μL， 充分混匀， 37℃放置 30 分钟后，以标准曲线 0 号管做参比，在 562nm 波长下比色，记录吸光值； 6. 根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（ μg），除以样品稀 释液总体积（ 100μL），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单 位： μg/ μL）。 . 注意事项 配制好的混合 BCA工作液室温 24 小时内稳定。 加入 BCA 工作液后，也可以在室温放置2 小时，或 60℃放置 30 分钟。 BCA法测定 蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升 高而加快。如 果浓度较低，适合在较高温度孵育，或延长孵育时间。 待测样品浓度在 50～ 2000 微克 / 毫升浓度范围内有较好的线性关系。 BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，可以兼容样品中高达 5%的 SDS，5%的 Triton X-100， 5%的 Tween 20, 60, 80。但受螯合剂和略高浓度的还原剂的影 响，需确保 EDTA低于 10mM ，无 EGTA，二硫苏糖醇低于 1mM ， β-巯基乙醇低于 1mM. 不适 BCA 法时 建议使用 Bradford 蛋白浓度测定试剂盒。 操作时要带手套。 五、储存 BCA 试剂 A 和 BCA 试剂 B 室温保存，蛋白标准液 -20℃冻存。 2