水溶性亲和超滤载体的制备和应用_朱家文.docxVIP

V o l. 25 N o. 6 华 东 理 工 大 学 学 报 1999-12 Jou rn al of Eas t C h ina U n ivers ity o f S cience and T ech no logy 563 水溶性亲和超滤载体的制备和应用+ 朱家文* 1, 曹学君2, 武 斌1, 戴干策1, 邬行彦2 1. 华东理工大学化学工程研究所, 上海 200237; 2. 华东理工大学生化工程系 ) 摘要: 用 D ex tran T 2000, 经环氧氯丙烷交联并氧化产生部分羧基, 偶联对氨基苯甲脒制得水 溶性亲和载体巨配基。配基密度为 71. 4μm o l /g。截留分子量为 10万的超滤膜对所制亲和载体的截 留率大于 99. 5%, 但尿激酶能自由通过。 将比活为 500IU /A 280的尿激酶粗品经亲和超滤得到纯化 的尿激酶, 比活达 66 300IU /A 280, 纯度提高 133倍, 回收率达 83. 4% 。 关键词: 亲和超滤; 葡聚糖; 尿激酶; 对氨基苯甲脒; 环氧氯丙烷 中图分类号: Q 503; Q 55 文献标识码: A 文章编号: 1006-3080( 1999) 06-0563-04 亲和超滤纯化活性蛋白药物是近年来颇受关注的生物分离新技术, 其特点是将亲和吸附与超滤结合起来, 兼具两者分离选择性好、提纯倍数高、能大规模连续操作和易于放大等优点。 亲和超滤所用空白载体有两类, 一类是水不溶性微载体 [1～ 3 ], 另一类是水溶性大分子载体[ 4～ 5]。 利用水溶性载体有许多优点: 亲和载体与目标蛋白在均相体系中反应速度 , 达到吸附或洗脱平衡的时间极短, 吸附容量大。这一点对亲和超滤很有利, 可以将目标蛋白溶液与 亲和载体溶液, 一边混合, 一边进行超滤, 而无需另 备储槽进行反应; 洗脱时也一样[6 ]。 另外, 水溶性亲和载体的吸附容量较大。 葡聚糖是应用较多的水溶性载体, 因其为天然 产物, 对人体安全, 相对分子质量大, 易于被膜截留,适用于注射用蛋白质药物的分离。 文献报道的亲和载体制备方法是将葡聚糖在催化剂存在下用环氧氯 丙烷进行活化, 产生末端为氯的活性基团, 进而与配 基偶联。 此方法配基偶联反应活性低, 反应时间长 [7～ 8 ]。 另一种制备葡聚糖亲和超滤载体的方法[ 9] 为葡聚糖在碱性下, 以环氧氯丙烷活化, 经胺化, 再与琥珀酸酐作用, 得到羧基末端, 再与配基偶联。 以 该方法制备的载体用于亲和超滤研究取得了较好的结果, 但该法反应步骤多, 操作繁琐, 收率低。 本文提出了一种新的制备葡聚糖亲和超滤载体的简易方法, 利用在碱性下加热, 当无还原剂存在时, 部分葡萄糖分子产生羧基, 同时, 加环氧氯丙烷 进行交联[ 10], 然后, 在水溶性碳二亚胺存在下直接与带氨基的配基偶联而得到亲和载体。 国家自然科学基金资助项目 ( * - : @ . . com . cn 收稿日期: 1999-01-18  材料与方法 1. 1 材料 -戊二酰-甘氨酰 -精氨酰 -7-氨基 -4-甲基香豆 (GGA -M CA )和对氨基苯甲脒, 美国 S igm a公司; EDC ( 1-乙基 -3-( 3-二甲氨丙基 )碳二亚胺盐酸盐 ), 德国 M ERCK 公司; D ex tran T 2000(相对分子质量200万 ), Pharm acia 公司; 尿激酶标准品, 购于中国 药品生物制品检定所; 尿激酶粗制品, 购于上海医药工业研究院生化室; 环氧氯丙烷为分析纯。 1. 2 仪器 F 950荧光分光计, 上海第三分析仪厂; M 750 微量可见紫外分光光度计, 上海生化所研制, 江苏泰州无线电仪器厂生产。中空纤维超滤器 (截留分子量为 10万 ), 天津纺织工学院生产。 平板超滤器 (截留分子量为 5 000), 美国 M ilipo re公司生产。 1. 3 分析方法 对氨基苯甲脒配基密度测定: 配基偶联后, 超滤 反应液, 取超滤液在 292nm 测紫外吸光度, (E 1% = 1cm 800) [8 ]; D ex tran T 2000浓度测定: 用旋光法 ( [T]= 199°)[11 ]; 羧基密度测定: 0. 1m o l/L H C l滴定, pH 从 7. 0滴定至 3. 0[12 ]; 尿激酶活力测定: 荧光分光 法[13 ], 发射波长为 380nm, 激发波长为 460nm; 蛋白质浓度测定, 在 280nm 处的紫外吸光度。 1. 4 亲和载体制备 取 2g D ex tran T 2000, 0. 8g (相当于 0. 4m o l /L N aC l) N aOH 溶于 50