第6章中性样品：反相与正相HPLC.docxVIP

10 10 PAGE PAGE # 第6章 中性样品：反相与正相 HPLC 6-1引言 如1-4节中所论述，HPLC方法建立的最佳途径由样品的性质决定。本书中所推荐的 HPLC方法建立策略按一般样品或特殊样品进行分类，见 图1-3。一般样品又分为中性样品 和离子样品，离子样品包括含有一种或多种离子的或可电离的化合物（如酸、碱、 有机盐）。 本章讨论仅含有不可电离化合物的中性样品。而离子化合物的 HPLC方法建立将在第7章 中讨论；不过这里所讨论的许多中性化合物的分离方法也同样适用于离子样品。 对于同时含 有中性和离子样品的 HPLC方法建立在 第9章中讨论。 第一部分反相色谱 反相色谱（RPC）是分离大多数常规样品的首选分离模式， 该模式的普适性一般比其它 液相色谱模式更好，更方便，获得令人满意的最佳分离效果的可能性更大。 RPC色谱柱柱 效高、稳定、重现性好（见5-3节）。所采用溶剂的性质决定了这种模式往往更易于检测 （尤 其是UV检测器），因此大多数色谱工作者采用 RPC分离模式多于其它 HPLC模式。 尽管许多有机化合物在（水溶液）流动相中溶解度有限，但由于RPC的进样量很少（纳 克或微克）（见2-4节），实际上并不会影响其应用。当样品在 RPC流动相中溶解度太小时， 正相色谱（NPC）则是较好的选择。同样，那些在水溶液中不稳定的样品也可用非水溶剂以 NPC模式进行分离。 有些样品用RPC分离较困难，必须采用其它模式进行分离。含下述化合物之一的样品 为特殊样品（见 图1-3）：强亲水或强疏水化合物、非手性异构体、手性异构体（即对映体， 见第12章）、生物大分子（见 第11章）。无机离子或合成聚合物也很“特殊” ，但本书中不 作讨论。强疏水样品由于在 RPC中被强保留，可能需采用非水条件（非水反相色谱或 NARP， 见6-5节），正相色谱（NPC）也可进行这类分离（见 本章第二部分）。强疏水的生物大分子 则可采用疏水作用色谱（HIC ）分离，将在 第11章中讨论。强亲水样品在 RPC中往往保留 不足，亲水离子样品的分离祥见 第7章的讨论。由于中性亲水化合物在 NPC柱上保留很强， 用NPC分离很好（见 6-6与6-7节）。某些亲水化合物也可以采用亲水作用色谱（ HILIC） 进行分离（详见 6-6-5节与第11章的讨论）。 非手性异构体（包括立体异构体、非对应异构体、位置异构体等）可以采用某些 RPC 条件分离。但异构体混合物通常采用 NPC （见6-7节）或以环糊精键合固定相的 RPC （见 6-3-3节）进行分离，手性对映体的分离须用特殊条件，详见 第12章的讨论。 6-2反相色谱的保留 RPC的保留机理如 图6-1所示。RPC分离类似于从水中萃取不同化合物至有机溶剂 （如 辛醇），疏水（非极性）化合物更易于萃取至非极性的辛醇相中。 色谱柱（一般用C8或C18 键合相修饰的硅胶担体）的极性弱于（水 -有机）流动相。样品分子在极性流动相和非极性 固定相间进行分配，疏水强的（非极性）化合物保留较强。因此，对于一定组成的流动相， 样品依其疏水性，保留值不同，所得色谱图如 图6-1所示。亲水（极性）组分保留较弱，先 从柱上流出；疏水（非极性）组分后流出；中等极性组分居中流出。 化合物的RPC保留值由其极性和实验条件（包括流动相、色谱柱和柱温）决定。如 表 6-1所示，有数种方式可改变 RPC中大多数组分的保留值。虽然仍不清楚反相保留的详细机 理，但保留值可以通过分配过程近似估算出。 不考虑保留机理，人们对改变实验条件（流动 相、色谱柱、柱温）产生的影响已作了深入的研究，因此可以系统地研究 RPC的方法建立 （如本章和第9章所述）。 极性 非极性亲水性疏水性1 .1 极性 非极性 亲水性 疏水性 1 . 1 1 ：i J J \ 1 1 J , j 1 11 1 1 1 1 ir 1 1 1 r 1 1 1 0 1 2 扌4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 图6-1非离子样品的反相分离过程示意图 黑点表示在极性流动相和非极性固定相间分配的样品分子 6-2-1流动相的影响 通过改变流动相组成或溶剂强度调整保留值（ k值）较好。在 RPC中，采用弱极性的 强流动相相对溶质保留值较小。溶剂的极性可由极性指数 P 表示（见附录n中表n -2）。 溶剂强度取决于所选用的有机溶剂和其在流动相中的浓度： %B，一般A代表水，B代表有 机溶剂，％为体积百分比。方法建立的初始目的是使所有样品化合物有适宜的保留值。如 第 2章所述，用等度条件分离样品时， 容许的保留值范围为 0.5k20，不过1k10 —般更好。 表6-1 RPC中改变保留值的方法 减小保留 增大保留 提高柱极性（氰基、C4）