陆生抑藻细菌分离鉴定及其对赤潮微藻米氏凯伦藻抑藻效果及机制研究.pdfVIP

摘要 陆生抑藻细菌分离鉴定及其对赤潮微藻 米氏凯伦藻抑藻效果及机制研究 摘要 有害赤潮暴发能够破坏海洋生态系统，对水环境、人类健康及各国经济构成严重威胁。 寻找有效赤潮防治手段成为当前研究的重要方向。有研究已表明海洋环境中存在对赤潮微 藻生长具有显著抑制作用的微生物，且在有害赤潮防治方面表现出较大潜力。此背景下， 本文从海水及河流入海口土壤中筛选对赤潮微藻米氏凯伦藻具有抑制效果的细菌，并探究 其对米氏凯伦藻的生长抑制效果、抑制方式及抑制机理。主要研究结果如下： 1、米氏凯伦藻抑藻细菌分离鉴定 通过共培养实验，从海洋环境筛选到9 株抑藻菌，从河口土壤筛选到5 株抑藻菌，通 过16S rRNA 测序确定菌株种属信息，并构建系统发育树。其中，海洋环境筛选到的抑藻 菌主要分布于海源菌属、盐单胞菌属、海杆菌属、副球菌属、红杆菌科、交替单胞菌属， 48 h 抑藻率可达58%-83%；土壤环境筛选到的抑藻菌主要分布于库克菌属、黄杆菌属、 假交替单胞菌属，48 h 抑藻率可达 90% 以上，且黄杆菌和假交替单胞菌皆以间接作用方 式抑藻。 2 、假交替单胞菌胞外活性物质对米氏凯伦藻生长生理抑制机理 (1) 将假交替单胞菌无菌滤液与赤潮微藻米氏凯伦藻共培养，2%滤液体积下，藻细胞 生长速度优于对照组，随着滤液体积增加，藻细胞生长受到抑制，4%滤液体积为“最低 抑制浓度”，8%滤液体积为“饱和效应浓度”；并于倒置荧光显微镜下观察藻细胞数量及 形态，发现随着滤液体积的增加及作用时间的延长，藻细胞逐渐破裂为细胞碎片，绿色荧 光下呈现黄绿色。 (2) 通过流式细胞术检测藻细胞周期，发现4%滤液体积作用12 h，可将藻细胞周期 阻滞在G2 期；滤液体积增大至8%，藻细胞基因组DNA 片段丢失，出现30% Sub-G1 峰。 因此推测滤液短时间、低浓度作用下，藻细胞周期被阻滞在G2 期；长时间、高浓度作用 下，藻细胞DNA 片段丢失，可能发生藻细胞凋亡。 (3) 8%体积滤液胁迫下，藻细胞内活性氧累积，且作用3 h 活性氧水平最高，荧光显 微镜下观察到此时藻细胞完整呈现红色但形态发生不规则变化，作用6 h 活性氧水平下降， 此时藻细胞破裂呈现黄绿色。 (4) 不同体积滤液胁迫下，藻细胞内Caspase-3 酶的活性增强，在6 h 时活性达最高 水平，外加活性氧抑制剂NAC 后检测发现，藻细胞内Caspase-3 酶活性显著降低，表明 活性氧累积可激活Caspase-3 酶活性。 (5) 流式细胞术检测表明，假交替单胞菌无菌滤液处理下，藻细胞发生凋亡，且随滤 I 摘要 液增加，藻细胞凋亡率升高；此外，随着处理时间延长，凋亡率也随之增大。推测可能是 Caspase-3 酶的激活导致细胞凋亡发生，外加活性氧抑制剂 NAC 及 Caspase-3 酶抑制剂 Ac-DEVD-CHO 后，藻细胞凋亡率降低，表明ROS 介导的 Caspase-3 酶依赖性凋亡通路 参与了菌滤液所致藻细胞的凋亡。 关键词：赤潮，米氏凯伦藻，抑藻细菌，周期阻滞，凋亡通路 II Abstract Algicidal bacteria associated with harmful bloom-forming Karenia mikimotoi in estuarine soil and study on the algicidal effect and mechanism Abstract Harmful algal blooms is able to destroy the marine ecosystem and the