线粒体电子传递链缺陷的小鼠胚胎干细胞系的构建.pdfVIP

摘要 摘要 胚胎干细胞是来源于哺乳动物早期胚胎的全能性细胞，它能够在体外无限制地增殖、 分化，具有发育为完整个体的潜能。胚胎干细胞内表达 Oct4、Sox2、Nanog 等转录因子， 这些调节因子形成了一个多能性调控网络，通过彼此调节表达水平来维持ESCs 的多能性。 线粒体代谢在干细胞命运决定中起着非常重要的作用，而我们前期的研究已经证明，线粒 体稳态的维持对干细胞自我更新能力及多能性的维持起着非常关键的作用，但具体的调控 机制还有待于进一步阐明。正常体细胞中，缺氧环境中线粒体靠糖酵解产生少量ATP ，有 氧条件下主要靠氧化磷酸化产生的ATP 供能。而胚胎干细胞线粒体的供能方式及具体的机 制还没有一个清晰的结论。复合体III 处于电子传递链的核心位置，它将复合体I 和复合体 II 通过辅酶Q 传递过来的电子继续向细胞色素c 传递，同时将质子泵出线粒体内膜形成膜 电势。TTC19 作为线粒体复合体III 中一个重要的装配因子，对于复合体III 二聚体的形成 至关重要，对线粒体电子传递与氧化磷酸化功能起关键的调控作用。我们以小鼠胚胎干细 胞为研究对象，选取了线粒体复合体III 的装配因子TTC19 作为靶标，来研究氧化磷酸化 缺陷对于胚胎干细胞干性的维持有何影响。 在本实验研究中，我们首先初步分析了小鼠胚胎干细胞和胚胎成纤维细胞中线粒体的 功能。与体细胞相比，胚胎干细胞氧化磷酸化与ATP 产生之间是低耦联的，但是也具有完 整的线粒体功能。利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术，针对Ttc19 基因的外显子作为靶序列 在网站上设计 gRNA ，构建pX330-gRNA-Cas9 质粒，利用核转染技术将质粒转染到小鼠 ESCs 中。经过检测切割效率，我们选择效率最高的gRNA 相对应的质粒去构建Ttc19 基因 敲除的小鼠 ES 细胞系。挑选单克隆后扩大培养，当细胞数足够时收集部分细胞提取其基 因组DNA ，扩增需要检测的靶序列及其上下游共约700bp 大小的DNA 片段，进行TA 克 隆后挑取单菌落送去测序。根据测序结果，选择有且只有两种编辑结果所对应的细胞系， 即为我们需要的Ttc19 敲除细胞系，核型检测显示为正常的二倍体核型。通过与野生型ESCs 在能量代谢上的比较，证明 Ttc19 敲除ESCs 的线粒体氧化磷酸功能受到了明显的抑制， 同时对构建好的Ttc19 敲除的 ES 细胞系进行自我更新能力检测、检测多能性基因在转录 水平和蛋白水平的表达，我们发现其多能性也较野生型明显降低。此结果表明，敲除Ttc19 基因造成胚胎干细胞的氧化呼吸链的缺陷会使其多能性降低。本研究中成功构建Ttc19 基 因敲除的ES 细胞系，为进一步研究线粒体功能与干细胞命运调控的机制提供了重要的细 胞模型。 关键词：胚胎干细胞，线粒体代谢，电子传递链，TTC19 ，CRISPR/Cas9 I Abstract Abstract Embryonic stem cells are pluripotent cells derived from mammalian early embryos, which can proliferate and differentiate indefinitely in vitro and have the potential to develop into intact individuals. Embryonic stem cells express transcription factors such as Oct4, Sox2 and Nanog, which form a pluripotent regulatory network and maintain the pluripotentcy of ESCs by regulating the expression level of each other. Mitochondrial metabolism plays a very important role