人胚胎干细胞向多巴胺前体细胞的分化研究.pdfVIP

摘要 摘 要 人口老龄化会面临各种退行性疾病的高发。其中，神经系统的退行性疾病占有很大的 比例。本课题主要围绕帕金森病 （Parkinson’s disease, PD ）的细胞疗法展开研究，为之后研 究中脑DA 神经元的发育路径，PD 发病机制和开展PD 的细胞疗法奠定了坚实的基础。 PD 的发病机制主要是中脑黑质（substantia nigra pars compacta, SNc ）区域DA 神经元 的死亡导致多巴胺（dopamine, DA ）分泌量减少。开展PD 的细胞治疗，最重要的是要得 到源源不断的供体细胞，即DA 神经前体细胞。本课题主要研究目标是建立DA 神经元的 分化体系，为PD 的细胞疗法提供细胞。采用的策略是将人胚胎干细胞( human Embryonic Stem Cells, hESCs )定向分化为DA 前体细胞从而得到供体细胞。首先，通过添加特定组合 的因子将hESCs 诱导分化为神经底板细胞( neural floor plate cells , NFP )，这部分细胞能够 表达神经底板细胞的标志物LMX1A , FOXA2, OTX2 。然后，经过FGF8 等因子的诱导，神 经底板细胞能够分化为DA 前体细胞，这些细胞能够表达中脑的标志物LMX1A, FOXA2, EN1 。我们将其体外培养发成熟为多巴胺神经元后，它能够表达成熟DA 神经元的标志物 TH, TUJ1 。 为了探究不同hESCs 的分化潜力是否存在差异，我们采用了12 株hESCs 进行了DA 的分化。实验结果证明，不同hESCs 分化产生的DA 神经前体细胞的效率是不同的，并筛 选出了一株DA 分化潜力较高hESCs ，为DA 的分化提供种子细胞。 目前建立的DA 神经元的化体系仍有不足之处。第一个不足之处是：DA 前体细胞的 标志物LMX1A 的表达比例过低。通过查阅文献发现LMX1A 在发育上是由WNT 通路调 控的，而CHIR99021 是WNT 通路的激活剂，所以我们利用了H9-LMX1A 的报告细胞系 对CHIR99021 的最适浓度进行了筛选，进而上调LMX1A 的表达水平。第二个不足之处是 试剂不符合临床要求。由于基础级B27 中含有BSA 成分，我们更换为临床级B27 。实验结 果证明临床级B27 可以较好的取代基础级B27 。第三个不足之处是DA 神经元的分化效率 较低。本课题使用两种方法来提高DA 神经元的分化效率。一种提高效率的方法是通过延 长两种营养因子GDNF 和TGFβ3 的作用时间来为DA 神经元提供分化所需的营养物质， 进而提高LMX1A ，FOXA2 ，EN1 ，TH，TUJ1 的表达比例。另一种方法是在ES 细胞诱导 分化为神经细胞的过程中，通过降低高SHH 的浓度，同时加入 SHH 的激活剂PP 来增强 腹侧化程度来提高DA 神经元的分化效率。从分化成本上看，SHH 是一种蛋白质，价格较 贵，这样也可以减少DA 神经元的分化的成本，这为后续大量提供DA 细胞治疗PD 提供 了很大的帮助。 综上所述，本课题主要包括三个部分：DA 神经元分化体系的建立，不同hESCs 向DA 分化潜力的差异性研究，DA 神经元分化体系的优化。这不仅为PD 的细胞治疗提供了充足 I 摘要 的供体细胞，还为DA 分化体系的优化提供了宝贵经验。 关键词：帕金森病，多巴胺，人胚胎干细胞，神经底板细胞，多巴胺神经前体细胞，多巴 胺能神经元 II Abstract Abstract The aging of the population face a high incidence of various degenerative diseases. Among them, the degenerative diseases of the nervous system account for