酿酒酵母和乳酸克鲁维酵母的表型试验方法、酿酒酵母和乳酸克鲁维酵母的 26S rDNA D1 D2 序列分析方法（PCR 方法）.pdfVIP

GB/T XXXXX—XXXX 附 录 A （资料性附录） 酿酒酵母和乳酸克鲁维酵母的表型试验方法 A.1 设备和材料 除另有规定外，实验用水应符合GB/T 6682-2008中三级水的要求。 A.1.1 超净工作台。 A.1.2 恒温培养箱。 A.1.3 恒温水浴培养箱。 A.1.4 光学显微镜：放大倍数400以上。 A.1.5 高压灭菌锅。 A.1.6 天平：感量0.01 g。 A.1.7 pH计或pH比色试管或精密pH试纸。 A.1.8 无菌培养皿：直径90 mm。 A.1.9 无菌锥形瓶：250 mL、500 mL。 A.1.10 试管：15 mm×150 mm。 A.1.11 无菌盖玻片：75%乙醇浸泡的清洁盖玻片。 A.1.12 无菌载玻片：75%乙醇浸泡的清洁载玻片。 A.2 培养基和溶液 A.2.1 麦芽汁液体培养基：分别称取麦芽膏粉130.0 g，氯霉素0.1 g，加入到1000 mL水中，加热溶解， 调节pH至5.6±0.2，分装至试管中，在高压灭菌锅中115 ℃灭菌15 min。 A.2.2 麦芽汁琼脂培养基：分别称取麦芽膏粉130.0 g，氯霉素0.1 g，琼脂15.0 g，加入到1000 mL水 中，加热溶解，调节pH至6.0±0.2，分别分装至锥形瓶中和试管中，在高压灭菌锅中115℃灭菌15 min。 A.2.3 玉米粉琼脂培养基：称取12.5 g黄玉米粉加入到300 mL水中混匀，置恒温水浴培养箱中以60 ℃ 热水浴保温1 h，用滤纸过滤，滤液加水至300 mL，加入3.8 g琼脂，加热溶解，分装至锥形瓶中，在 高压灭菌锅中115 ℃灭菌15 min。 A.2.4 麦氏 （McCLary）培养基：分别称取葡萄糖1.0 g、氯化钾1.8 g、酵母膏2.5 g、醋酸钠8.2 g、 琼脂20 g，加入到1000 mL水中，加热溶解，调节pH至6.4±0.2，分装至试管中，在高压灭菌锅中115 ℃ 灭菌15 min。。 A.2.5 酵母粉-蛋白胨-葡萄糖 （YPD）液体培养基：分别称取酵母粉5.0 g、蛋白胨10.0 g、葡萄糖20. 0 g，加入到1000 mL水中，加热溶解，分装至试管中，在高压灭菌锅中116 ℃灭菌15 min。 3 GB/T XXXXX—XXXX A.2.6 YM琼脂培养基：分别称取酵母浸膏3.0 g、麦芽粉3.0 g、蛋白胨5.0 g、琼脂20.0 g，加入到10 00 mL水中，加热溶解，分装至锥形瓶中，在高压灭菌锅中121 ℃灭菌15 min。 A.2.7 无菌生理盐水：将8.5 g氯化钠加入到1000 mL水中，搅拌至完全溶解，分装后，在高压灭菌锅 中121 ℃灭菌15 min。 A.2.8 染色液 A.2.8.1 孔雀绿染液：称取5.0 g孔雀绿置于烧杯中，加入少许水中充分混匀，待完全溶解后，转移至 100 mL容量瓶，加水定容，并摇匀。 A.2.8.2 番红水溶液：将0.5 g番红加入少许水中充分混匀，待完全溶解后，再加水至100 mL。 A.3 试验步骤 A.3.1 无菌要求 全部操作过程均应遵循无菌操作程序。 A.3.2 菌株活化 A.3.2.1 样品处理：半固体或液体菌株直接活化。固体菌株或真空冷冻干燥菌株，可先加适量无菌生 理盐水或其他适宜稀释液，溶解菌粉后再活化。 A.3.2.2 活化：用接种环挑取一环或两环处理好的样品 （A.3.2.1）接种在麦芽汁液体培养基中，25 ℃ ±1 ℃培养48 h~72 h，获得培养物。 A.3.3 酿酒酵母的鉴定 A.3.3.1 接种和培养 A.3.3.1.1 取一环或两环活化的培养物 （A.3.2.2）接种在麦芽汁液体培养基中，在25 ℃±1 ℃恒温培 养箱中培养3 d。观察是否形成菌醭、菌环或岛，并用无菌水制作水浸片在显微镜下观察，记录酵母细 胞的形状、大小及增殖方式。 A.3.3.1.2 取活化后的培养物 （A.3.2.2