三维培养在小鼠原始生殖细胞体外分化的应用.pdfVIP

摘要 摘 要 原始生殖细胞（primordialgermcells,PGCs）是生殖系细胞最早在个体体内出 现的，具有精子或卵子发生两个方向的分化潜能。小鼠胚胎干细胞（mouse embryonicstemcells mESCs epiblastlikecells EpiLCs ， ）在体外，经上胚层样细胞（ ， ） 阶段，分化成小鼠原始生殖细胞样细胞（mousePGC-likecells，mPGCLCs）， 利用唯支持细胞综合征的新生小鼠睾丸细胞与分化得到的mPGCLCs 混合培养， 在视黄酸、睾酮促性腺激素及垂体提取物等的刺激下，完成减数分裂得到球形精 子。虽然可以通过体外分化得到球形精子，但目前的小鼠生殖细胞体外分化系统 分化效率低，不能解决目标细胞的大规模获得问题。 三维细胞培养技术因其在细胞培养过程中更类似体内微环境，能够增大目标 细胞的获得量和获得效率，是近年来细胞培养研究的趋势。在哺乳动物生殖细胞 分化的过程中尚无关于三维细胞培养技术的相关报道。本实验主要在传统分化体 methylcellulose MC 系基础上，在培养基中添加甲基纤维素（ ， ），因其粘稠特性 减慢了细胞球沉降速率，而形成简单的三维细胞培养状态，并在此基础上优化了 分化实验过程，为实现mPGCLCs 的大量获得做了初步探索，为进而建立一个体 外三维细胞分化体系奠定了重要基础。 本课题选用共表达BPT （同时有Blimp1、Prdm14 和Tfap2c 三个转录因子） mESCs EpiLCs mPGCLCs 的转基因 进行体外分化，在 和 诱导分化阶段的培养阶 段加入0.3%的MC 进行三维培养，并优化了EpiLCs 阶段的分化培养基。EpiLCs 阶段的免疫荧光染色结果显示Oct4 的表达符合这一阶段的特征，之后对比传统 培养方法，流式细胞荧光分选技术(fluoresvemceactivatedcellsorting,FACS)分析 结果显示改良后的mPGCLCs 分化效率未有提高。更进一步的Real-timePCR 对 day4 的mPGCLCs 的关键基因表达谱分析，多能性基因和PGCs 阶段基因的表达 mPGCLCs 状态正常，分化效率未有提高，但是水平与传统培养体系的结果相吻 合。上述结果说明优化实验流程后得到的统计发现，相同量培养基的条件下 mPGCLCs 的获得率有4 倍左右提高。虽然本项目没有做进一步的功能实验，但 I 摘要 是实验结果对体外三维分化体系得到大量目的细胞，提供了最初的方法和技术支 持。 关键词：小鼠胚胎干细胞；原始生殖细胞；甲基纤维素；三维细胞培养 II Abstract Abstract Primordialgermcellsaretheearliestgermlinecellsgeneratedinthebody,which havethepotentialtodifferentiatetospermoroocyte. Mouse embryonic stem cells can differentiate into mouse primordial germ cells-likecells(mPGCLCs)throughepiblastlikecellsstageincertainconditionsin vitro. With the stimulation of retinoic acid, testost